色谱柱的选择及应用

宋学英 杨 华

(首都医科大学医学实验测试中心现代药学测试室 北京 100069)



色谱柱的选择及应用

宋学英 杨 华

(首都医科大学医学实验测试中心现代药学测试室 北京 100069)

目的:分析时正确选择色谱柱,使其能够达到较好的分离效果。方法：通过综述色谱柱的分类、基质及不同键合相的最新发展状况，结合自身的科研工作实例说明不同的色谱柱对样品分离效果的重要影响以及色谱柱在使用过程中的维护方法。结果：正确选择色谱柱能够达到较好的分离效果。结论：不同基质的色谱柱对样品的分离效果不同,实验中需要根据样品性质选择合适的色谱柱；做好色谱柱的日常维护,才可以提高色谱柱的使用寿命。

色谱柱 选择 维护

在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想的分离，是色谱工作者的重要工作。色谱是一种分离分析的手段，分离是核心，因此可以说担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏[1]。对色谱柱的要求是：柱效高、选择性好，分析速度快等[2]。目前市售的用于HPLC的各种色谱柱种类繁多，从色谱柱填料来分，可分为硅胶基质和有机杂化球基质的色谱柱，还有不同长短、不同微粒大小的色谱柱，因此选择一个合适的色谱柱非常重要。

1 实验材料与仪器

液相色谱仪：1525-2487:1525泵、2487双波长紫外检测器，美国沃特世 ；CoulArray5600，包括：EAS482泵、ESA542自动进样器、CoulArray 5600 8通道库仑阵列检测器，美国戴安 ；色谱柱：ESA MD150×3.2 3μm美国戴安 ；Symmetry 150×3.9 5μm ；SymmetryShield 150×4.6 5μm； Nova Pak 150×4.6 4μm 均为美国沃特世；zorbax SB-c18 150×4.6 5μm 美国安捷伦；色谱甲醇(Fisher美国)；其余均为分析纯试剂。

2 色谱柱的选择

色谱柱的选择可根据待分析样品的极性、分子量大小、是否可溶于水等因素来考虑。如样品分子量大于2000的，可溶于水的，可选择凝胶色谱柱、大孔径反相色谱柱、大孔径离子交换色谱柱。分子量小于2000的，溶于有机相的，可选择正相模式色谱柱。溶于水，可电离的样品可选择反相模式(用离子对试剂的键合固定相、用离子化控制键合固定相)色谱柱或离子交换或未经涂渍亲水模式的色谱柱等。

2.1 色谱柱的分类

色谱柱可分正相模式色谱柱、反相模式色谱柱和亲水模式柱[3]

正相模式色谱柱：采用极性固定相(如乙二醇、氨基与腈基等键合相)；常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)。

反相模式色谱柱：一般用非极性固定相，以硅胶为基质键合不同的基团(如C18、C8)；适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相色谱(RPC)在现代液相色谱中应用最多，据统计它占整个HPLC应用的80%左右[4]。由于超临界色谱的崛起，一些过去用正相色谱的实验逐渐被超临界色谱所代替,所以反相色谱柱的应用将会更加广泛。

随着色谱柱填料的快速发展，某些无机样品或易解离样品的分析也可用反相色谱法。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲盐控制流动相的pH值。硅胶基质键合相(C8和C18)色谱柱使用的pH值通常为2.5～7.5(2～8)，太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落[2]。近年来技术的更新，利用包被、空间位阻、杂化颗粒等新技术，已经可以使硅胶基质的色谱柱使用范围扩大到pH为 1～12，流动相为较强酸性或碱性时，可选择宽pH值的色谱柱。

亲水(HILIC)模式：HILIC不同于反相色谱技术，流动相为反相色谱的流动相，它提供了相对于反相的互补选择性，通常可保留传统反相色谱方法无法保留的高极性化合物。需要注意的是HILIC模式中硅胶基质无键合相的色谱柱，流动相pH适用范围。

2.2 固定相的基质

2.2.1 无机基质

无机基质有硅胶、羟基磷灰石、石墨化碳、氧化铝、氧化钛以及氧化锆等金属氧化钛等[5]。硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱所用填料。

2.2.2 有机聚合物基质

以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC，它们的压力限度比无机填料低。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强。可使用任何流动相，在整个pH范围内稳定，可以用氢氧化钠或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强，但它可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。虽然不如苯乙烯-二乙烯苯那样耐酸碱，但也可以承受在pH13下反复冲洗。所有聚合物基质在流动相发生变化时都会出现膨胀或收缩，用于HPLC的填料其膨胀和收缩要有限制。因为小分子在聚合物基质中的传质比在陶瓷性基质中慢，所以造成了小分子在这种基质中柱效低。对于大分子像蛋白质或合成的高聚物，聚合物基质的效能与硅胶基质相差无几。因此，聚合物基质更广泛用于分离大分子物质[5]。

2.2.3 键合相的种类

化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。

常用的极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相[1,2,5]。极性键合相常用作正相色谱，混合物在极性键合相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用，极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相,如氨基柱。

常用的非极性键合相主要有各种烷基(C1～C18)和苯基、苯甲基等，以C18应用最广[1]。非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保留值和分离选择性都有影响，一般来说，样品容量随烷基链长增加而增大，且长链烷基可使溶质的保留值增大，常常可改善分离的选择性；但短链烷基键合相具有较高的覆盖度，分离极性化合物时得到的色谱峰对称性较好。苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似，适用于分离芳香化合物。

分离中等极性和极性较强的化合物可选择极性键合相。氰基键合相：对于双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离，有较好的选择性。氨基键合相：具有较强的氢键结合能力，对如甾体、强心甙等有较好的分离能力；并被广泛用于糖类的分析，但它不能用于分离羰基化合物，如甾酮、还原糖等。二醇基键合相适用于分离有机酸、甾体和蛋白质等。

分离非极性和极性较弱的化合物可选择非极性键合相。C18柱稳定性较高，这是由于长的烷基链保护了硅胶基质的缘故，C18基团空间体积较大，有效孔径小，所以C18色谱柱更适合分离小分子化合物。利用特殊的反相色谱技术，例如反相离子抑制技术和反相离子对色谱法等，非极性键合相也可用于分离离子型或可离子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是应用最为广泛的非极性键合相，它对各种类型的化合物都有很强的适应能力。

对于极性比较大的化学物还可采用HILIC模式的色谱柱，HILIC的保留机制是基于分配、离子交换、氢键作用等复杂机制，从而获得对极性分子物有更强的保留能力[6]，如分离糖类化合物，可选用键合酰胺键的硅胶基质的色谱柱。

2.3 色谱柱的应用

以最常用的C18色谱柱为例，不同厂家或相同厂家不同系列的色谱柱之间存在一定的差异，如填料均为C18的色谱柱就有含有亲水基团和不含亲水基团色谱柱，含亲水基团的色谱柱可以用100%水相作为流动相，而不含亲水基团的色谱柱用纯水作为流动相会造成色谱柱疏水塌陷，柱效降低。

2.3.1 不同型号的色谱柱对分离结果的影响

在分离ATP、ADP、AMP时，由于样品的极性较强，流动相为缓冲盐及1%甲醇的缓冲盐溶液，用Waters SymmetryShield RP C18的色谱柱就可以得到较好的分离，如图1所示。而用Agilent SB-C18的色谱柱不能得到满意的色谱图，这是因为Waters SymmetryShield这款色谱柱键合了亲水基团，可以使用纯水作为流动相，而Agilent SB-C18不含亲水基团，使用纯水作为流动相会降低柱效。所以在分离极性较大的化合物需要使用纯水作为流动相时，应使用含亲水基团的 C18色谱柱或亲水模式的色谱柱。

利用反相离子对色谱法分离极性化合物，含亲水基团和不含亲水基团的色谱柱其保留能力不相同，通常在没有应用离子对试剂时，我们认为含亲水基团的色谱柱保留极性化合物的能力更强，但在应用了离子对试剂后，含亲水基团的色谱柱的保留能力不一定比不含亲水基团的色谱柱保留强，如用Symmetry C18测定多巴胺、多巴柯、五羟吲哚乙酸、五羟色胺、及高香草酸时，相同条件下(流动相：柠檬酸50mM、无水乙酸钠70mM、EDTA-2Na 0.2mM、辛烷磺酸钠0.2mM，缓冲盐：甲醇=92∶8，pH=4.1)两种色谱柱保留时间有所不同，含亲水基团的色谱柱保留时间更短，分离效果不如普通的C18柱，五羟色胺与高香草酸未完全分开，如图2所示。

这可能是离子对试剂可以与C18结合形成带电的基团，而含亲水基团的C18柱与离子对试剂结合不如C18柱强，因此对于用离子对色谱，C18的色谱柱保留更强(图3)。

2.3.2 不同pH值对色谱柱分离结果的影响

如用ESA MD150×3.2mm, 3μm的色谱柱测DA、DOPAC、5=HIAA、5-HT、HVA时pH=3.5和pH=4.1时提保留时间及保留顺序均发生了变化(流动相为70mM的乙酸钠，50mM的柠檬酸，0.2mM EDTA-Na，0.2mM辛烷磺酸钠，1.32%三乙胺用乙酸或氢氧化钠调pH值分别为3.5)，如图4所示。pH3.5时， 多巴胺与多巴柯没有完全分开，pH4.1时5个峰得到也较好的分离，出峰顺序较pH3.5时发生了改变，多巴胺与多巴柯位置相互交换了，高香草酸与五羟色胺位置也进行了交换。所以说pH值不同，色谱柱的选择性也不相同，通过改变流动相的pH值，可以达到改善分离度的目的。

2.3.3 不同型号的色谱柱分离结果的差异

同样用Waters 公司不同型号的色谱柱分离DA、DOPAC、5=HIAA、5-HT、HVA，其分离的效果也不相同，如图5所示。

由图5可以看出相同条件下，Nova Pak C18150×3.9 4μm不能将多巴胺与多巴柯很好的分离，而Symmetry C18150×3.9 5μm的色谱柱5种物质得

到了较好的分离，这说明虽然都是C18的色谱柱其填料也会有一定的差异。

2.4 色谱柱清洗与使用中的注意事项

2.4.1 常用硅胶键合相色谱柱的清洗与再生

对于常用的硅胶键合相的色谱柱被污染后，表现为：色谱峰变形，柱压升高，保留时间改变等，说明色谱柱需要清洗，色谱柱的清洗与再生方法见表1[7]。

由于离子对试剂污染的色谱柱很难冲洗干净，如在测定多巴胺、五羟色胺及其代谢产物的实验中，色谱柱被离子对试剂污染，保留时间延长，用异丙醇冲洗色谱柱，保留时间恢复正常，但再次实验时，又会表现为保留时间延长，因此离子对试剂污染了色谱柱很难恢复。

表1 色谱柱清洗和再生程序

2.4.2 键合相色谱柱的使用注意事项

色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。

(1) 避免压力、温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或色谱柱从高处掉下都会影响柱床；柱压的突然升高或降低也会对柱床有影响，因此要缓慢升高或降低流速，阀进样时，阀的转动不宜过缓(如前所述)[8-10]。

(2)应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱，不应直接从有机溶剂直接改变为水相，反之亦然。

(3)一般说来色谱柱不宜反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲以除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

(4)避免生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理，还可以在进样器和色谱柱之间连接保护柱。保护柱是与色谱柱填料相似的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。

(5)经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在清洗色谱柱时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50～75mL。

(6)保存色谱柱时应用乙腈或柱说明书上指定的溶剂充满色谱柱，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥，绝对禁止将缓冲盐溶液留在柱内静置过夜。使用含有缓冲盐的流动相时，可先用高比例的水替换掉色谱柱中的有机相，然后再用含有缓冲盐的流动相，实验结束后，用高比例的水替换掉缓冲盐，冲洗20倍的柱体积，再逐渐升高有机相的比例，直至100%乙腈或高比例乙腈，冲洗20倍柱体积，保存色谱柱。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4～5天开机冲洗15分钟。

总之，对于色谱工作者,正确选择色谱柱，可以使所分析的样品得到理想的分离效果，维护好色谱柱可以使色谱柱的使用寿命大大提高，从而提高色谱柱的使用效率。

[1] 郑伟，孙东方.高效液相色谱柱的选择、使用与维护[J].口腔护理用品工业.2011,21(6)：37-39.

[2] 崔莹.HPLC色谱柱的使用和维护[J].科技风.2011,8(下)：88.

[3] 徐红，侯健.高效液相色谱的色谱柱的类型和流动相的选择方法[J].计量与测试技术.2010,(2)：10.

[4] 张冬青,张星亚.ODS 反相键合相色谱柱的使用、维护[J].安徽电子信息职业技术学院学报.2014，(5)：45-48.

[5] 蒋生祥, 刘 霞.硅胶基质高效液相色谱固定相[J].色谱.2007,(3):163-173.

[6] 李瑞萍,袁琴,黄应平. 硅胶色谱柱的亲水作用保留机理及其影响因素[J].色谱.2014,(7)：675-681.

[7] 宋学英,杨华,赵逸松，等.高效液相色谱仪的应用分析[J].中国医学装备.2015,(1):29-31.

[8] 赵青山,李冬梅，魏丽娜.高效液相色谱柱使用与维护[J].生命科学仪器.2006,(4)：11-15.

[9] 刘育红,王季鸽. 色谱柱的维护与保养在高压液相色谱中的应用[J].中小企业管理与科技下旬刊.2010,(2)：201.

[10] 刘翻, 熊志超, 张凌怡，等. 高效液相色谱柱清洗与再生方法[J]. 分析测试技术与仪器.2010,16(2)：71-77.

Selection and application of chromatographic column.

Song Xueying,Yang Hua

(CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

In this paper, the latest development of the types, matrix, the bonded phase and the application of chromatographic column were introduced.

chromatographic column; selection; maintenance

宋学英，女，1964年出生， 副主任技师，首都医科大学医学实验与测试中心现代药学测试室， 主要从事液相色谱仪的管理、维护及相关测试，E-mail:13521292345@163；com；songxy@ccmu.edu.cn。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.06.019

2016-06-23