利用microCT研究硫化铋纳米棒在小鼠体内的分布

王东亮 何芳菲 郭宏博 胡西学 王昱青 郑晓鹏 甘雅玲

(1. 国家纳米科学中心纳米生物仪器平台， 北京 100190；2 .中国科学院高能物理研究所中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室， 北京 100049)



研究与讨论

利用microCT研究硫化铋纳米棒在小鼠体内的分布

王东亮1何芳菲1郭宏博1胡西学1王昱青1郑晓鹏2甘雅玲1

(1. 国家纳米科学中心纳米生物仪器平台， 北京 100190；2 .中国科学院高能物理研究所中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室， 北京 100049)

MicroCT在分子影像学研究中有广泛的应用，将硫化铋纳米棒灌胃给药后，利用microCT对小鼠在不同时间点进行扫描，实时监测纳米材料在小鼠体内的分布和代谢。计算小鼠各组织不同时间点的HU值，分析获得纳米材料在小鼠不同组织内随时间变化的累积及代谢情况。

MicroCT HU值 纳米材料

MicroCT(micro computed tomography，微计算机断层扫描技术)，又称微型CT、显微CT，是一种非破坏性的3D成像技术，可以在不破坏样本的情况下清楚了解样本内部显微结构。X射线球管发射的X射线穿透样本，最终在X-射线检测器上成像，可对样本进行360°多角度成像。 MicroCT的应用领域主要有骨研究、牙齿及牙周组织研究、生物材料、疾病机制研究、新药开发等，主要是对活体小动物、硬组织和相关软组织进行扫描成像分析,阐明疾病或肿瘤在发生和发展过程中的分子相互作用，评价药物和造影剂的生物效应，并动态连续监测药物在同一个体的分布及治疗效果[1-3]。

现代分子影像学研究离不开能够在分子、细胞和动物水平检测生物和疾病发生过程的探针，以及有效提高成像分辨率的造影剂，纳米材料作为新型成像造影剂，在现代医学成像技术中发挥着越来越重要的作用[2]。硫化铋可制备成各种不同尺寸、不同形状的纳米结构，不同的结构有着各种独特的电学、光学特性[4，5]。同时，由硫化铋制备所得的纳米棒有很强的X射线吸收能力和在生物体内更多的循环次数，在CT扫描时作为造影剂比传统碘酸盐造影剂具有优势，可以提高检测的灵敏度和准确性，作为造影剂有很好的应用潜力。目前对硫化铋纳米材料的研究多集中在不同的制备方法及其独特的电化学、光学性能方面[4，5]，有些研究者则研究硫化铋纳米棒生物检测器对DNA或miroRNA的检测[6，7]，而硫化铋纳米棒还可以作为药物载体，装载药物后进入体内，实现治疗与成像检测的诊疗一体化。研究者发现，硫化铋可实现多模态成像，同时用于荧光、光声和CT成像检测[8]，硫化铋纳米棒经小鼠尾静脉注射后，在肝和脾有较为明显的聚集，但在不同时间、不同脏器的分布细节尚不清楚。目前常规研究药物在动物体内的分布代谢所采用的方法多是收集其不同时间点的排泄物并取心、肝、脾、肾等脏器后利用ICP-MS、切片手段等研究其分布和代谢[9，10]，不仅工作量大，而且由于实验动物的个体差异，实验误差较大，本实验利用硫化铋纳米棒具有较好的CT成像特性，制备合成了硫化铋纳米棒，探索利用microCT实时检测纳米材料及药物在动物不同组织内分布的方法。

1 实验方法

1.1 硫化铋纳米棒的制备和修饰

制备方法如文献所述[8]，具体步骤如下：称取1.45 g新十二酸铋放入圆底烧瓶中，加入20 mL油酸和10 mL乙醇，室温下搅拌0.5 小时。将0.15 g硫代乙酰胺完全溶于4 mL 油胺，快速加入含有新十二酸铋的圆底烧瓶，然后将烧瓶放置的搅拌台上，剧烈搅拌 0.5小时。待混合均匀后，将混合液体转移到50 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中。把反应釜密封以后放置到烘箱里，在150oC 下放置10小时。自然冷却至室温后，通过12000 rpm离心收集产物，并用无水乙醇洗涤3次，去除可能的杂质。

称取50 mg 油酸包覆的Bi2S3纳米材料，分散于20 mL环己烷中，在剧烈搅拌下接着滴加100 μL 吐温-20，室温下搅拌1小时。量取30 mL二次水加入100 mL圆底烧瓶中，在水浴条件下加热到70oC，在剧烈搅拌下，滴加上述硫化铋的环己烷溶液。在70oC下搅拌3小时来蒸干环己烷，随着环己烷的蒸发，硫化铋纳米材料慢慢的转到水相中。最后，通过离心收集产物，并用无水乙醇洗涤3次，最终得到的硫化铋纳米材料能很好的分散在水中并通过透射电镜观察制备所得的纳米Bi2S3的形貌。

1.2 小鼠体内Bi2S3纳米棒的分布研究

取制备好的Bi2S3纳米棒用生理盐水溶解成为30mg/mL的溶液，取15g左右的Balb/c裸鼠，灌胃200μL后利用microCT进行实时扫描观察。

1.3 MicroCT扫描数据获取及处理

CT扫描所采用仪器为国家纳米科学中心生物仪器平台的Triumph X-SPECT2h/X-OCT(TriFoil Imaging, Inc.)，扫描电压为60 kV，电流250 μA，视野FOV为8cm×8cm，图像处理采用系统自带软件Amira 4.1，采用软件自带插件计算所获取图像的HU值。

2 实验结果

2.1 硫化铋纳米棒制备完成后

取10 μL滴到铜网上，干燥后在透射电镜下观察，结果图1所示，显示制备所得纳米棒基本为棒状，长约50 nm左右，宽约6纳米，比较均一。

2.2 硫化铋纳米棒在小鼠体内的分布

对小鼠进行麻醉后，取200 μL硫化铋纳米棒溶液对小鼠进行灌胃，完毕后马上进行CT数据采集，将采集获得的数据利用Amira 进行三维重建后生成CT图像，结果如图2所示。

从图2中可以看出,灌胃前,小鼠的胃和肠道基本是空的, 灌胃后进行扫描，10分钟时，小鼠的胃部充满了硫化铋纳米棒，少部分硫化铋已经到达了小肠部分。随着时间的推移，硫化铋逐渐从胃部进入小肠。随着硫化铋在小鼠小肠部位的聚集，小肠的CT图像越来越清晰，亮度越来越高。随着时间的延长，硫化铋也逐渐从小肠进入到大肠，大肠体积变大，显示硫化铋在大肠中累积起来。

在本实验中所使用的小鼠是处于存活状态，通过microCT扫描获取的图像无法明确区分小鼠肠道如十二指肠、空肠、回肠、结肠等各个具体部分，我们仅按照文献[11]的研究方法，简单分成了小肠和大肠，如图3所示，利用Amira影像分析软件分别计算了小鼠的胃部、小肠和大肠在不同时间点的HU值及其体积。

CT扫描所获得的某组织的HU值与该组织对X射线的吸收量有关，吸收的X射线越多，HU值越大，在其它条件都不变的情况下，小鼠某组积累积的硫化铋纳米棒越多，吸收的X射线也将越多，因此小鼠组织的HU值与该组织累积的硫化铋的量是相关的。从图4可以看出，小鼠被灌胃硫化铋后，胃部的HU值增高，然后逐渐下降，这说明硫化铋进入小鼠胃部后随即进入小肠，在小肠部位会逐渐累积，直到1.5小时达到最大值，在此期间，小鼠大肠部位的HU值没有明显变化，说明硫化铋纳米棒还没有进入大肠。当灌胃1.5小时后，硫化铋逐渐从小肠进入大肠，大肠的HU值有升高，但升高的幅度却小于小肠HU值的下降幅度，这可能是由于部分硫化铋进入大肠后，通过排便行为被排出了小鼠体外，在小鼠扫描床及扫描间隙放置小鼠的纸盒中，都发现了一定量的小鼠粪便。

从图2的H图上可以看出，小鼠被灌胃6小时后，大肠部位应该有大量的硫化铋，但图4显示，6小时小鼠大肠部位的HU值并没有明显升高，这显示硫化铋在此处并没有大量聚集。因此我们检查了不同时间点小鼠CT断层扫描图片。如图5所示，灌胃90分钟后，小鼠的小肠内充满了硫化铋，整条小肠的亮度很高。而在灌胃6个小时后，硫化铋基本上只是存在于小鼠大肠的肠壁上，大部分已经通过小鼠的排便行为排出。

3 讨论

利用microCT检测纳米材料在小鼠体内的分布已经有相当多的研究，如研究者发现一定尺寸的纳米金颗粒经小鼠尾静脉注射后可富集于肾脏中，可作为CT造影剂用于肾脏成像[12]；掺杂有铷元素的三氧化钨可制成RbxWO3纳米棒，同时用于小鼠肿瘤的热疗和CT成像[13]；TPGS修饰后的上转换发光纳米材料NaYbF4:Er不仅可以用于荧光/CT的双模态成像，还可以作为药物载体装载抗肿瘤药物后用于抗性肿瘤的治疗[14]。这些研究均利用microCT对纳米材料进行了成像，并取得了良好的结果，但是这些纳米材料在小鼠体内不同组织间随时间的变化关系尚不清楚。建立一种可以实时检测此类纳米材料或载药纳米颗粒在小鼠体内不同组织内分布的方法，对于深入开展纳米材料在动物水平的生物效应研究有很大的帮助。对于纳米金、硫化铋纳米棒等一批具有良好CT成像效果的纳米材料而言，利用microCT进行成像，与荧光成像、PET和SPECT成像相比，具有独特的优势：它有远超荧光探针的穿透深度，易于实现小鼠体内各组织的高分辨成像，而且microCT不像PET和SPECT那样成像时需要放射性核素，应用更安全、方便。本研究显示，利用microCT有可能实现对纳米颗粒或载药纳米颗粒在小鼠体的分布变化的实时监测，与需在不同时间点处死小鼠检测不同组织内的药物含量相比，获取更接近小鼠生理状态下的实验数据。

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Research on distribution of bismuth sulfide nanorods in vivo by microCT.

Wang Dongliang1, He Fangfei1, Guo Hongbo1, Hu Xixue1, Wang Yuqing1, Zheng Xiaopeng2, Gan Yaling1

(1.NanobiologicalInstrumentPlatform,NationalCenterforNanoscienceandTechnologyofChina,Beijing100190,China;2.KeyLaboratoryforBiomedicalEffectsofNanomaterialsandNanosafety,InstituteofHighEnergyPhysics,ChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)

The microCT was used for scanning the mice at different times by microCT, and monitoring the real-time distribution and metabolism of nano materials in vivo after the intragastric administration of the bismuth sulfide nanorods. The CT HU values of mice tissue at different times were calculated, and the accumulation and metabolism of nano materials in mice were analyzed.

microCT; HU values; nano material

王东亮，男，1978年出生，博士，现就职于国家纳米科学中心纳米生物仪器平台，工程师，研究方向：分子影像学，E-mail：wangdl@nanoctr.cn。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.06.015

2016-09-30