流动注射化学发光法在线检测饮用水中的3-硝基丙酸

张旭辉

唐书泽1

邓小玲2

吴事正2

(1. 暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632；2. 广东省疾病预防控制中心，广东 广州 510300)



流动注射化学发光法在线检测饮用水中的3-硝基丙酸

张旭辉1

唐书泽1

邓小玲2

吴事正2

(1. 暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632；2. 广东省疾病预防控制中心，广东 广州 510300)

利用碱性条件下3-硝基丙酸对鲁米诺—高锰酸钾化学发光体系有显著的抑制作用，结合流动注射分析技术，建立了一种在线检测饮用水中3-硝基丙酸的流动注射化学发光新方法。 在优化的试验条件下，其线性范围为1～150 mg/L，方法的检出限为0.28 mg/L，相对标准偏差为1.9%，3-硝基丙酸加标回收率为76.5%～93.8%。该方法具有较好的准确性和选取性，可实现饮用水中3-硝基丙酸的快速在线检测。

流动注射；化学发光；3-硝基丙酸；在线检测

3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid，3-NPA)是一种溶于水和极性有机溶剂的无色针状晶体[1]，是由某些高等植物或真菌产生的天然嗜神经毒素[2-3]，可引起人畜中毒[4]。常见的能在体内合成3-NPA的真菌包括节菱孢[3]、链丝菌、放线菌[1]、黄曲霉、米曲霉等[5]。变质甘蔗中毒自1972年在中国报告以来[6]，在中国13个省和自治区都有案例，由于甘蔗污染了节菱孢霉产生3-NPA引起的中毒事件在中国北方地区时有发生，急性期表现有呕吐、昏迷、阵发性抽搐等，常常表现为中枢神经系统的损害[7]。3-NPA对小鼠口服的LD50为60～80 mg/kg[8]。刘兴阶等[9]发现，小鼠、大鼠、猫和狗为该毒性物质的敏感动物，能引起急性神经中毒和死亡，并推算出人类对3-NPA的中毒剂量为12.5 mg/kg(3-NPA对人类的毒性属剧毒级，人类较啮类动物的敏感性高约5倍[10])。3-NPA作为一种常见易得的强毒性神经毒素，很容易作为饮用水中潜在的投毒物质使用。鉴于近年来，人为投毒事件频频发生，引起了社会各界的广泛关注和警惕，因此建立一种快速检测饮用水中3-NPA的检测方法具有非常重要的意义。

目前对3-NPA的检测方法多为薄层色谱法[11-12]、毛细管电泳法[13]、免疫离子色谱法[14]、气相色谱法[15]、高效液相色谱法[16-17]、固相萃取—超高效液相色谱串联质谱法[18]等。这些方法存在需使用大量毒性大的有机试剂、操作复杂、检测周期长等缺点。与上述方法比较，流动注射化学发光法由于操作简单，灵敏度高，能实现连续进样进行在线监测，已被广泛应用于食品科学、环境监测和药物分析等领域[19]。本课题组已对秋水仙碱[20]、桔霉素[21]、棒曲霉素[22]等食源性毒素进行了快速检测和预警研究。本试验拟利用3-NPA对鲁米诺—高锰酸钾发光体系发光信号的抑制作用和3-NPA浓度线性关系，结合流动注射分析技术与化学发光法，建立一种用于饮用水中3-NPA突发性污染的快速在线检测方法。

1 材料与方法

1.1 主要设备与试剂

1.1.1 主要设备

微弱发光测量仪：BPCL-K型，北京亚泊斯科技有限公司；

智能流动注射进样器：IFIS-C型，西安瑞迈分析仪器有限责任公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9145A 型，上海一恒科学仪器有限公司；

荧光/磷光/发光分光光度计：LS-45/55型，美国Perkin Elmer公司；

紫外可见分光光度计：UV-2550型，苏州岛津公司；

微量移液枪：100～1 000 μL，德国BRAND公司；

电子天平：EL104型，梅特勒—托利多仪器有限公司。

1.1.2 主要试剂

鲁米诺：分析纯，美国Sigma公司；

高锰酸钾：分析纯，衡阳凯信化工试剂有限公司；

氢氧化钠：分析纯，天津市福晨化学试剂厂；

3-NPA：分析纯，美国Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 进样方法 如图1所示，A、B流路分别泵入鲁米诺溶液和样品溶液，在混合管路进行预混合，C流路泵入高锰酸钾溶液，各流路溶液在六通阀处混合反应产生荧光。发光信号由光电倍增管放大后，再通过信号转换在计算机上以峰高显示。以水作为空白试验时产生的空白信号为I0，注入3-NPA产生的抑制信号计为Ia，通过相对发光强度ΔICL(ΔICL=I0-Ia)进行定量。

A. 鲁米诺溶液 B. 样品溶液 C. 高锰酸钾溶液 P. 蠕动泵 M. 混合管 V. 六通阀进样器 F. 流通池 W. 废液池 NHV. 负高压 PMT. 光电倍增管 PC. 电脑

图1 流动注射化学发光流程图

Figure 1 Schematic diagram of flow-injection chemiluminescence system

1.2.2 单因素试验 选取影响化学发光强度的3个主要因素：鲁米诺浓度、氢氧化钠浓度、高锰酸钾浓度，在控制流动注射速率为1 mL/min，光电倍增管负高压为800 V的情况下进行试验，考察3个因素对相对化学发光强度的影响。

(1) 鲁米诺浓度：高锰酸钾浓度为1×10-5mol/L，氢氧化钠浓度为0.10 mol/L，3-NPA浓度为5 mg/L时，比较鲁米诺浓度在0.1×10-4，0.5×10-4，1×10-4，2×10-4，3×10-4，4×10-4，5×10-4，6×10-4mol/L时的相对化学发光强度。

(2) 氢氧化钠浓度：鲁米诺浓浓度为2×10-4mol/L，高锰酸钾浓度为1×10-5mol/L，3-NPA浓度为5 mg/L时，考察氢氧化钠浓度在0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14 mol/L 时的相对化学发光强度。

(3) 高锰酸钾浓度：氢氧化钠浓度为0.10 mol/L, 鲁米诺浓度为2×10-4mol/L，3-NPA浓度为5 mg/L时，高锰酸钾浓度分别在0.1×10-5，1×10-5，2×10-5，3×10-5，4×10-5，5×10-5，6×10-5，8×10-5mol/L时的相对化学发光强度。

1.2.3 正交试验 根据单因素试验结果，确定正交试验需考察的3个因素的3个水平，控制流动注射速率为1 mL/min，负高压为800 V ，采用L9(34)正交试验表设计试验，每个因素水平组合进行3次平行试验，优化得到相对化学发光强度最大且稳定的试验条件。在优化的试验条件下，对鲁米诺—高锰酸钾—3-NPA体系进行相对发光强度测定，并进行3次平行验证实验。

1.2.4 干扰试验 饮用水中的金属离子，以及样品中的氨基酸、维生素、糖类等可能存在的杂质对3-NPA的测定结果有干扰作用。在优化条件下，当3-NPA的浓度为5 mg/L时，考察样品中可能的共存物对3-NPA测定结果的影响。

1.2.5 反应机理探讨 为了探讨反应机理，试验利用LS-45/55荧光/磷光/发光分光光度计在最大激发波长345 nm下分别分析鲁米诺溶液、鲁米诺—高锰酸钾混合液、鲁米诺—高锰酸钾—3-NPA混合液的荧光光谱。并用UV-2550紫外可见分光光度计在200～800 nm下对3种溶液进行紫外吸收光谱分析。

2 结果与分析

2.1 化学发光抑制作用试验结果

待鲁米诺高锰酸钾发光体系趋于稳定后，分别加入0.5，5，50，150 mg/L浓度的3-NPA，发光信号峰值随着3-NPA浓度的递增呈现下降的趋势(见图2)，且相对发光强度与3-NPA浓度之间有良好的线性关系。由此可见3-NPA对鲁米诺—高锰酸钾体系有显著的抑制作用，流动注射化学发光法可用于对饮用水中3-NPA进行检测。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 鲁米诺浓度的选取 鲁米诺的浓度大小是影响体系相对化学发光强度的直接因素[23]。由图3可知，体系相对化学发光强度随着鲁米诺溶液浓度的增加先增大后减小，在2×10-4mol/L左右达到最大，所以，认为2×10-4mol/L为适宜的鲁米诺浓度。

图2 化学发光抑制曲线Figure 2 Inhibited curve of the chemiluminescence system

图3 鲁米诺浓度与相对发光强度的关系Figure 3 Effect of luminol concentration on relative luminescence intensity

2.2.2 氢氧化钠浓度的选取 由图4可知，体系相对化学发光强度随着氢氧化钠溶液浓度的增加先增加，在0.10 mol/L时体系相对发光强度最大。所以，选取氢氧化钠浓度为0.10 mol/L。2.2.3 高锰酸钾浓度的选取 高锰酸钾作为发光体系的氧化剂[24]，其浓度的大小对体系相对化学发光强度有显著影响。由图5可知，随着高锰酸钾溶液的浓度增加到2×10-5mol/L 前反应体系相对化学发光强度逐渐增强，进一步增加高锰酸钾浓度，相对发光强度逐渐减弱并趋于稳定，所以，认为2×10-5mol/L为适宜的高锰酸钾浓度。

图4 氢氧化钠浓度与相对发光强度的关系Figure 4 Effect of NaOH concentration on relative luminescence intensity

图5 高锰酸钾浓度与相对发光强度的关系Figure 5 Effect of KMnO4concentration on relative luminescence intensity

2.3 正交试验结果

依据单因素试验结果，采用L9( 34) 正交试验设计因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

由表2可知，反应体系最优化组合为：A3B2C1，在优化试验条件下选取鲁米诺浓度为3×10-4mol/L，氢氧化钠浓度为0.10 mol/L，高锰酸钾浓度为1×10-5mol/L，通过3次平行实验进行验证得其相对发光强度为3 986，除第8组外，大于正交试验表中所有的因素水平组合的试验结果，考虑到第8组即为优化试验的组合，且微弱发光测量仪存在一定的信噪比，因此可以认为本试验优化的参数可靠。由表3中方差分析结果3个因素的F值均小于F临界值可知，各因素对化学发光强度没有显著性影响，分析原因，一方面3-NPA改变了体系的碱性环境，降低了鲁米诺的发光效率；另一方面3-NPA的加入使高锰酸钾的氧化性增强，提高了体系的发光效率。

表2 L9(34)正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design matrix and test results

表3 方差分析结果Table 3 Variance analysis of the orthogonal test results

2.4 干扰试验

表4 不同干扰物质的耐受浓度比Table 4 Tolerable concentration ratio of different interfering substance

2.5 标准曲线、精密度和检出限

以3-NPA溶液浓度为横坐标，空白体系的发光强度和加入3-NPA溶液后的发光强度差值为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，3-NPA对照样品浓度在1～150 mg/L时与发光强度呈线性关系，回归方程y=176.5x+5 168，相关系数R2=0.998，通过对3-NPA浓度为1～12 mg/L的12份样品溶液进行测量，经计算得到方法检出限为0.28 mg/L。对5 mg/L 3-NPA平行测定11次，RSD为1.9%，由此说明仪器的精密度良好。由表5可知，本试验的检测方法与薄层色谱法、毛细管电泳法等传统的检测方法相比具有线性范围宽，检出限低等优点；与高效液相色谱法和气相色谱法等方法相比较，虽然检出限相对较高，但其检测时间大大缩短，仪器简单，操作简便，便于实际应用中的突发性污染快速检测。

2.6 回收率试验

以屈臣氏蒸馏水、实验室自来水和珠江水为水样在正交试验优化的条件下，进行3-NPA的加标回收试验，结果(见表6)表明，加标回收率范围为76.5%～93.8%。实验室自来水和珠江水主要存在金属离子等杂质，由于部分金属离子能增强体系的发光强度，抵消了3-NPA对体系的抑制作用效果，因而回收率偏低。

2.7 反应机理探讨

通过考察鲁米诺、鲁米诺—高锰酸钾、鲁米诺—高锰酸钾—3-NPA 三组溶液的发射光谱(图6)可知，鲁米诺—高锰酸钾与鲁米诺—高锰酸钾—3-NPA 两个化学发光体的最大发射波长与鲁米诺的均在425 nm左右，因此说明这两个化学发光体系的发光体均为激发态的3-氨基邻苯二甲酸根。鲁米诺—高锰酸钾—3-NPA体系的发光强度与鲁米诺—高锰酸钾体系相比明显降低，说明3-NPA的加入一定程度上抑制了鲁米诺—高锰酸钾的发光强度。紫外可见光谱图(图7)

表5 已报道的3-NPA检测方法数据分析

Table 5 Analytical performance data of previously reported works for the determination of 3-NPA

检测方法基质线性范围/(mg·L-1)检出限/(mg·L-1)参考文献薄层色谱法甘蔗1～102[12]毛细管电泳法甘蔗1～1000.3[13]免疫离子色谱法甘蔗0.1～50.00.03[14]气相色谱法(电子捕获检测器)动物血浆-0.004[15]反相高效液相色谱法米曲霉0.1～1.50.01[17]超高效液相色谱串联质谱法甘蔗、血清、尿液0.001～0.0500.06×10-3～0.3×10-3[18]固相萃取/超高效液相色谱-电喷雾质谱串联法酶制剂0.0125～0.12500.005[26]固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法甘蔗0.004～0.0400.001[27]流动注射化学发光法饮用水1～1500.28本文

表6 不同水样中3-硝基丙酸的回收率试验Table 6 Results for the determination of 3-NPA in environmental water samples (n=3)

图6 荧光光谱图Figure 6 Fluorescence spectrum

图7 紫外可见吸收光谱图Figure 7 UV-Vis absorption spectrum of CL system

结果表明，3组溶液均在301 nm和348 nm处有吸收峰，加入3-NPA之后发光体系吸收峰的位置并没有改变，也没有新的峰产生，说明3-NPA加入体系后并没有新的物质产生。以上分析可知3-NPA并没有参与体系的反应，推测其机制可能是激发态的3-氨基邻苯二甲酸根夺去了3-NPA的氢离子，改变了体系的发光环境，导致体系发光受到抑制。

3 结论

本试验利用3-NPA对鲁米诺—高锰酸钾体系有明显的抑制作用，建立了一种流动注射化学发光检测3-NPA的新方法。该方法在1～150 mg/L范围内，具有良好的线性关系，R2=0.998，检出限可达0.28 mg/L，回收率在76.5%～93.8%。该方法与现有的检测方法相比具有检测时间短，仪器简单，操作简便，而且能够实现在线连续检测等优点，可用于快速检测和预警饮用水中3-NPA的突发性污染。

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On-line determination of emergency pollution of 3-nitropropionic acid in drinking water by flow injection chemiluminescence

ZHANG Xu-hui1

TANGShu-ze1

DENGXiao-ling2朱 曜2ZHUYao2

WUShi-zheng2

(1.DepartmentofFoodScienceandEngineering,JinanUniversity,Guangzhou,Guangdong510632,China;2.GuangdongProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Guangzhou,Guangdong510300,China)

On the basis of inhibition of chemiluminescence reaction of luminol and potassium permanganate in sodium hydroxide medium by 3-nitropropionic acid, a novel flow-injection chemiluminescence method for determination of 3-nitropropionic acid in drinking water was developed. A linear range for 3-nitropropionic acid determination was 1～150 mg/L. The detection limit of 3-nitropropionic acid was 0.28 mg/L and relative standard deviation (RSD) was 1.9%, with the recovery of 76.5%～93.8%. This online determination system showed a good accuracy and selectivity and has great potential application in rapid detection and alarm of emergency pollution of 3-nitropropionic acid in drinking water.

flow injection; chemiluminescence; 3-nitropropionic acid; on-line monitoring

广东省公益研究与能力建设专项(编号：2014A020218009)

张旭辉，男，暨南大学在读硕士研究生。

唐书泽(1957—)，男，暨南大学教授，博士。 E-mail: tangsz@jnu.edu.cn

2016—08—06

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.010