部分杧果种质资源遗传多样性的SRAP和ISSR分析

张 宇，黄国弟，黄 强

(广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西 南宁 530001)

部分杧果种质资源遗传多样性的SRAP和ISSR分析

张 宇，黄国弟，黄 强

(广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西 南宁 530001)

利用SRAP和ISSR分子标记，对20份杧果种质资源进行遗传亲缘关系分析，为杧果种质资源的鉴定和杂交育种亲本选配提供参考依据。结果显示，在SRAP分析中，从80对引物中选出12对引物组合共扩增出224条谱带，每对引物组合扩增谱带数在13～21条，平均为18.7条，其中多态性谱带为194条，平均多态性谱带为16.2条，多态性比率为86.61 %，材料间相似遗传系数变化范围为0.54～0.94；在ISSR分析中，从100条引物中选出10条引物共扩增出179条谱带，每条引物扩增谱带数在11～20条，平均为17.9条，其中多态性谱带为153条，平均多态性谱带为15.3，多态性比率为85.35 %，材料间相似遗传系数变化范围为0.58～0.90。SRAP和ISSR标记分别在相似系数0.624和0.665水平上，均可将20份杧果种质资源分成4大类群，SRAP和ISSR标记都能将供试材料完全区分开来，聚类结果具有很高的一致性，均适用于杧果材料的遗传多样性分析，可用于杧果遗传亲缘关系的研究。

杧果；遗传多样性；SRAP；TRAP

杧果(MangiferaindicaLinnaeus.)属漆树科(Anacardiaceae)杧果属(MangiferaLinnaeus)多年生常绿果树，是与番荔枝、榴莲、香蕉、菠萝齐名的热带名果[1]。杧果产业的发展依赖于杧果新品种的推陈出新。20世纪90年代，基于DNA水平的多种分子标记技术相继出现，这些技术以其多态性丰富、数量多、不受环境影响等特点，为实现对植物基因型的选择提供了有力的工具，受到遗传育种学家的高度重视。分子标记技术的出现加速了杧果遗传育种的发展。尽管AFLP[2-3]、RAPD[4-6]、SSR[7-8]等标记技术在杧果的遗传多样性分析、DNA指纹图谱构建、品种鉴定等方面已有一些应用，但与苹果[9-10]、梨[11-12]等大宗果树相比，分子标记技术在杧果上的研究相对起步较晚、应用较为薄弱。SRAP[13]标记技术多用于杧果功能基因的定位，ISSR[14-16]标记技术应用于杧果亲缘关系鉴定和遗传规律分析的报道最多，但将两种标记结合起来用于杧果遗传多样性的研究鲜见报道。为此，本研究借助SRAP和ISSR分子标记技术，以广西亚热带作物研究所杧果种质资源圃内的杧果种质资源为材料，进行遗传多样性分析和评价，旨在明确杧果遗传多样性和亲缘关系情况，为今后杧果品种鉴别、杂交育种亲本选配、遗传关系及遗传多样性分析提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试的20份杧果种质资源均种植于广西亚热带作物研究所杧果种质资源圃(表1)。

1.2 研究方法

1.2.1 总DNA的提取和浓度测定 参考张宇等[17]的改良CTAB法提取DNA，用紫外分光光度计和1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度，将提取的DNA稀释为30 ng/μl，放入-20 ℃保存备用。

1.2.2 SRAP和ISSR反应体系的建立及优化 参考赵英等[18]和应东山等[19]发表的SRAP反应体系，利用正交优化法，优化PCR扩增体系为20 μl，包括25 mmol/L MgCl22 μl、10×PCR缓冲液 2 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、5 U/μlTaq酶 0.3 μl、30 ng/L模板DNA 3 μl、0.1 μmol/L上下游引物(表2)各2.5 μl、灭菌双蒸水1.2 μl，加5 μl石蜡进行扩增。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，(退火温度因引物不同而不同)退火1 min，72 ℃延伸2 min，5个循环；94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

参考笔者之前的ISSR反应体系，利用正交优化法，优化PCR扩增体系为20 μl，包括25 mmol/L MgCl22 μl、10×PCR缓冲液3 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、5 U/μlTaq酶0.5 μl、30 ng/L模板DNA 1 μl、0.1 μmol/L引物1 μl、灭菌双蒸水12.0 μl，加5 μl石蜡进行扩增。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，(退火温度因引物不同而不同)退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 SRAP和ISSR引物筛选 SRAP引物设计参考Li等[14]所用引物，设计5条正向引物和7条反向引物，共计35对引物组合，由上海生物工程股份有限公司合成。ISSR引物设计选择加拿大哥伦比亚大学(University of British Columbia,UBC)公布的100条引物，同样由上海生物工程股份有限公司合成。以桂热杧82号、桂热杧71号、紫花杧、金煌杧、金穗杧为模板，筛选出SRAP和ISSR引物(表2)。

表1 材料名称与来源地

注：M：多胚，P：单胚。

Note:M：Monoembryonic，P：Polyembryonic.

1.2.4 电泳检测 取8 μl扩增产物在2 %的琼脂糖电泳分离，电压为5 V/cm，电极缓冲液为0.5×TBE，电泳结束后用荧光核酸染料染色，在紫外分析仪上观察并照相。

1.2.5 数据分析 根据分子标记的迁移率及其有无，统计所有的二元数据。按条带有无赋值，有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，记录清晰、稳定的扩增带输入Excel 2007建立原始数据矩阵。应用NTSYS(version2.10)软件进行数据处理，采用非加权类平均法(UPGMA)进行聚类分析，得到遗传相似系数建立聚类分析树状图[20]。

2 结果与分析

2.1 SRAP和ISSR扩增多态性比较

设计正向引物5条，反向引物7条，共计12个引物组合。交由上海生物工程技术服务有限公司合成，为了得到有效的SRAP分子标记，此12对引物组合可以扩增出条带清晰、重复性好，多态性丰富的DNA电泳多态性谱带。进行SRAP扩增及数据分析，利用12对引物组合对20份杧果种质资源进行扩增，共产生224条清晰条带(图1)，平均每对引物扩增出18.7条，其中多态性谱带为196条，平均多态性谱带16.2条，多态性比率为86.61 %(表3)。选择加拿大哥伦比亚大学(University of British Columbia,UBC)公布的引物，进行序列设计与合成，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，为了得到有效的ISSR分子标记，对已合成的100条引物进行筛选，选出10条扩增清晰、重复性好，多态性丰富的引物，进行ISSR扩增及数据分析。利用10条引物对20份杧果种质资源进行扩增，共产生179条清晰谱带(图2)，平均每个引物产生17.9条谱带，其中多态性谱带为153条，平均多态性谱带15.3条，多态性比率为85.35 %(表3)。比较SRAP和ISSR扩增的总条带数和多态性谱带比率，SRAP标记多态性高于ISSR标记。

表2 SRAP和ISSR引物序列

表3 SRAP和ISSR扩增结果

经2 %琼脂糖凝胶电泳，并用紫外分析仪拍照可得SRAP和ISSR电泳图谱(图1和图2)。36对SRAP引物组合中，12对引物组合可以扩增出清晰、稳定、多态性高的DNA谱带，谱带分子量在100 ～2000 bp；100条ISSR引物中，10条引物可以扩增出清晰、稳定、多态性高的DNA谱带，谱带分子量在250 ～2000 bp。SRAP和ISSR标记均能扩增出符合研究预期效果的DNA多态性谱带，SRAP标记扩增谱带清晰度、层次感较ISSR标记扩增效果好，SRAP标记从较少的待选引物中筛选出较多的满足研究要求的引物，且SRAP标记扩增谱带分布范围较ISSR标记广。比较分析SRAP和ISSR标记扩增电泳图谱，杧果种质资源具有较高的SRAP多态位点。

M:DL2000 bp ladder;编号1～20同表1，下同M:2000 bp ladder;Code 1-20 are the same as the table 1.The same as below图1 SRAP引物组合Me3/Em14的扩增电泳图Fig.1 SRAP amplification profile of prime combination Me3/Em14

图2 ISSR引物UBC857的扩增电泳图Fig.2 ISSR amplification profile of prime UBC857

2.2 SRAP和ISSR聚类分析比较

利用UPGMA法对SRAP标记扩增结果进行聚类树状图构建(图3)。在遗传相似系数0.624处可将20份杧果供试材料分为4组，依次标记A、B、C、D。兴热1号在A组；虎豹牙、金煌杧在B组；云霞杧、粉红杧、沅江象牙杧、桂热杧82号在C组；象牙22、紫花杧、红苹杧、金穗杧、红玉杧、三蜜杧、桂热杧71号、杨杧、硕帅杧、矮杧、攀西红杧、白象牙、龙眼香杧在D组。在遗传相似系数0.665处B组分为B1和B2 2个亚组，金煌杧在B1组，虎豹牙在B2组；在遗传相似系数0.679处C组分为C1和C2 2个亚组，云霞杧、沅江象牙杧、桂热杧82号在C1组，红粉杧在C2组；在遗传相似系数0.662处D组分为D1和D2 2个亚组，象牙22、紫花杧、红苹杧、金穗杧、红玉杧、三蜜杧在D1组，桂热杧71号、杨杧、硕帅杧、矮杧、攀西红杧、白象牙、龙眼香杧在D2组。

按UPGMA法构建ISSR标记亲缘关系树状图(图4)。在遗传相似系数为0.665的水平上，将20份杧果供试材料分为4组，分别用A、B、C、D依次标记。兴热1号在A组；虎豹牙、金煌杧在B组；云霞杧、粉红杧、沅江象牙杧、桂热杧82号、象牙22、紫花杧、红苹杧在C组；金穗杧、红玉杧、三蜜杧、桂热杧71号、杨杧、硕帅杧、矮杧、攀西红杧、白象牙、龙眼香杧在D组。在遗传相似系数0.711处B组分为B1和B2 2个亚组，虎豹牙在B1组，金煌杧在B2组；在遗传相似系数0.728处C组分为C1和C2 2个亚组，云霞杧、沅江象牙杧在C1组，红粉杧、桂热杧82号、象牙22、紫花杧、红苹杧在C2组；在遗传相似系数0.739处D组分为D1和D2 2个亚组，红玉杧、三蜜杧、桂热杧71号在D1组，金穗杧、杨杧、硕帅杧、攀西红杧、白象牙、龙眼香杧在D2组。基于遗传相似系数的不同(图3～4)，利用UPGMA法对供试的20份杧果种质资源进行聚类分析，SRAP和ISSR 2种标记获得了相似但不完全相同的聚类树状图。

图3 基于SRAP标记遗传相似系数UPGMA聚类图Fig.3 Dendrogram generated by UPGMA methods based on genetic similarity from SRAP marker

图4 基于ISSR标记遗传相似系数UPGMA聚类图Fig.4 Dendrogram generated by UPGMA methods based on genetic similarity from ISSR marker

3 讨论与结论

3.1 SRAP和ISSR遗传多样性比较分析

杧果遗传多样性研究是杧果育种的重要环节[21]。运用分子标记技术研究杧果种质资源的遗传多样性，可以不受环境、时间、空间的限制，从基因组水平上揭示其遗传差异。ISSR标记技术是在SSR序列的5′或3′端锚定2～4个碱基为引物，降低其他可能靶标退火的数目。此方法的优势是在基因组上只有与锚定的碱基匹配的位点才能被靶定，规避了引物在基因组上的脱落，加大PCR扩增反应的确定性，ISSR标记是显性标记；引物设计是SRAP标记的核心，SRAP标记引物为双引物，在正向引物使用“CCGG”序列，结合可译框(ORFs)区域的外显子，但外显子通常具有保守特性，低水平的多态性限制了它们做标记的条件，内含子具有变异性大特点，碱基AT区域通常见于内含子中，SRAP标记反向引物的3′端含有核心AATT，以特异结合富含AT碱基区域，因此该标记可以扩增出基于内含子与外显子的SRAP多态性。本研究表明：SRAP扩增电泳对20份杧果种质资源共产生224条有效谱带，平均每对引物组合扩增出18.7条，其中多态性谱带为196条，平均多态性谱带16.2条，多态性比率为86.61 %；ISSR扩增电泳对20份杧果种质资源共产生有效谱带179条，平均每条引物产生谱带17.9条，其中多态性谱带为153条，平均多态性谱带15.3条，多态性比率为85.35 %。比较SRAP和ISSR扩增的总谱带数和多态性谱带比率，SRAP标记多态性高于ISSR标记。在20个供试杧果品种间，SRAP标记具有比ISSR标记更宽泛的变异范围，说明前者比后者具有更高的标记效率，更精确的遗传变异数据。SRAP和ISSR均可作为杧果品种遗传多样性的分析手段。相对来说，SRAP具有更高的多态性位点，能反映更多的遗传信息。

3.2 SRAP和ISSR聚类结果比较分析

分子标记的应用评价是开展分子遗传多样性研究工作的基础，不同的分子标记可能检测到的遗传信息水平不同[22]。在有些供试材料中甚至获得相去甚远的结果[23]。本研究中SRAP和ISSR分子标记对20份杧果种质资源进行遗传聚类分析获得了相似性较为一致的结果。如：在ISSR聚类分析中，云霞杧、粉红杧、沅江象牙杧、桂热杧82号、象牙22号、紫花杧、红苹杧聚类在C组；而在SRAP聚类分析中，云霞杧、粉红杧、沅江象牙杧、桂热杧82号聚类在C组，象牙22号、紫花杧、红苹杧却聚类在D组。在SRAP和ISSR分析中，C组和D组聚类树状图的格局有所不同，这主要是因为SRAP标记是在总结RAPD、AFLP标记优缺点的基础上开发出的一种基于PCR的DNA分子标记技术。SRAP标记引物设计简单，上游引物17 bp，下游引物18 bp，上下游引物之间可以随机搭配，两两组合，降低了引物的设计难度，提高了引物的利用效率[24]。SRAP标记主要是针对开放阅读框(ORF)进行扩增，主要扩增基因外显子区域，并根据194个变异的信息进行聚类。ISSR标记针对基因中高度重复序列进行扩增，无需预知物种基因组信息，信息量丰富、重复性好、呈显性标记、操作简单，因而被广泛应用于植物的遗传多样性研究中，并根据153个变异的信息进行聚类，从而导致了两种方法聚类结果存在一定差异[25]。从聚类的信息量来看，SRAP标记聚类结果可靠性更高。

SRAP标记继承了RAPD和AFLP标记的优点，克服了RAPD标记稳定差的缺点，同时克服了AFLP标记复杂的劣势。ISSR标记吸收了RADP和SSR标记的优点，比RADP标记稳定性高、多态性丰富，比SSR标记简单、无需特意性引物的设计[26-27]。本研究综合利用SRAP和ISSR标记分析了20份杧果种质资源的遗传多样性，2种标记均能产生各自有效的多态性谱带，并揭示出材料间的遗传差异，能很好地将所有材料加以区分。笔者分别用194个(SRAP)和153 (ISSR)个多态性位点分析20份杧果种质资源，所得到的结果能够真实、客观地反应出供试材料间的遗传关系。

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(责任编辑 王冠玉)

Analysis on Genetic Relationship of Some Mango(MangiferaindicaL.) Germplasms by SRAP Markers and ISSR Markers

ZHANG Yu,HUANG Guo-di,HUANG Qiang

(Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Guangxi Nanning 530001, China)

The genetic variation and relationship of 20 mango germplasms were analyzed by SRAP and ISSR molecular markers in order to provide references for the identification of mango germplasm resources and breeding selection of parents. In SRAP analysis, from 80 pairs of primers, 12 pairs of primers were selected and 224 bands were amplified. Each primer combination amplified polymorphism belt in 13-21, with the average of 18.7. There were 194 polymorphic bands, with the average of 16.2. Polymorphism ratio was 86.61 %. The genetic similarity coefficient of materials was 0.54-0.94. In the ISSR analysis, from 100 primers, 10 primers amplified 179 bands.Each primer amplified bands from 11 to 20, with an average of 17.9,of which 153were polymorphic bands. The average polymorphism was 15.3 and polymorphic ratio was 85.35 %.The genetic similarity coefficient of materials was 0.58 - 0.90. The results showed that SRAP and ISSR markers were at the similarity coefficient of 0.624 and 0.665 levels. 20 copies of mango germplasm resources can be totally divided into 4 groups by SRAP and ISSR markers. Clustering results, due to high similarity, can be used for genetic diversity analysis and genetic relationship study of mango.

mango；genetic diversity；SRAP；ISSR

1001-4829(2016)09-2045-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.007

2016-04-01

广西自然科学基金项目(2015GXNSFBA139085)；农业部热作农技推广与体系建设项目(16RZN-402)；国家行业(农业)科研专项经费项目(201203092-5)

张 宇(1983-)，男，河北博野人，助理研究员，主要从事果树生理与分子生物学研究工作，E-mail：375900554@qq.com。

S667.7

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