微生物转化去氢表雄酮生成7琢 15琢—二羟基雄烯醇酮的研究

蒋卫敏

摘 要：7α，15α-二羟基雄烯醇酮是合成屈螺酮的重要中间体，应用亚麻刺盘孢（Colletotrichum lini AS 3.4486）的羟化酶体系对去氢表雄酮（DHEA）底物进行转化，合成7α，15α-二羟基雄烯醇酮。文章采用平板筛选、投料方法、发酵过程的控制，在去氢表雄酮（DHEA）投料浓度10 g/L的条件下，转化率可达80%以上，主要产物为7α，15α-二羟基雄烯醇酮。比原来的投料浓度有较大的提高。

关键词：去氢表雄酮；亚麻刺盘孢；7α，15α-二羟基去氢表雄酮；微生物转化工艺

中图分类号：R977.1 文献标识码：A 文章编号：1006-8937（2016）33-0211-03

1 概 述

随着甾体化学的飞速发展，甾体激素类药物已逐渐成为医药领域的重要门类。屈螺酮是一种高效、低毒、副作用小的新一代女用避孕药。由于屈螺酮具有广阔的市场前景，其前体化合物7α，15α-二羟基去氢表雄酮也受到广泛关注。之前合成7α，15α-二羟基雄烯醇酮主要使用化学方法，由于化学法合成7α，15α-二羟基雄烯醇酮步骤繁琐，产物收率低，对人和环境影响大。

20世纪70年代德国先令首先将生物转化法用于屈螺酮的合成，利用微生物的羟化酶体系，在去氢表雄酮的C7和C15位引入羟基，得到7α，15α-二羟基去氢表雄酮，再经化学法合成屈螺酮。使用微生物法引入羟基缩短了屈螺酮的合成路线，但其转化效率较低。目前对去氢表雄酮转化效率比较高的菌株主要来自Colletotrichum lini属，但高浓度的DHEA对具有菌种具有毒害作用，因此寻找耐受性强、转化率高、生命力强的菌种非常重要。

由于丝状真菌的细胞壁成份复杂，直接以孢子或菌丝进行诱变比较难。本实验通过孢子稀释培养筛选生长速度快的菌种，选择加料溶剂、以及添加表面活性剂和各种转化条件的控制，达到最佳培养条件以提高投料浓度和转化率。

2 材料与方法

2.1 菌 种

亚麻刺盘孢由本实验室保存

2.1.2 培养基

斜面培养基PDA（g/L）：土豆200，葡糖糖20，琼脂20，pH自然

种子（发酵）培养基（g/L）：葡糖糖30，玉米浆10，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钾2，硫酸镁0.244，泡敌适量

2.1.3 试 剂

DHEA，7α，15α-二羟基去氢表雄酮，7α-羟基去氢表雄酮由本实验室分离制备。培养基各种营养成分购置上海试剂公司，投料使用的各种溶剂为工业级，分析使用试剂均为分析纯。

2.1.4 使用仪器

菌种培养箱（上海博讯实业有限公司SPX-150B-Z型），恒温摇床（上海世平的SPH-211C），台式离心机（TGL-16C高速离心机），立式电热压力蒸汽灭菌锅（上海申安LDZX-75KBS），菌种保藏（杭州华日电冰箱股份有限公司），超净工作台（苏州净化有限公司），显微镜， 高效液相色谱。

2.2 试验方法

2.2.1 生长速率快菌种筛选

PDA培养基的配置，土豆去皮称取200 g，切成小块置烧杯中加水1 000 ml，煮沸5～10 min，用纱布滤去土豆块，加水补充蒸发水分，加入20克葡萄糖和20克琼脂溶解，分装灭菌。灭菌之后均匀的倾到于平皿，冷却凝固，28 ℃培养2天备用。取保存菌种用无菌水洗下孢子，吸取1 ml加入到装有9 ml无菌水的试管中，为101，混合均匀之后按同样方法稀释，直至1010，取104～108每级涂布5个平皿，29 ℃培养。

2.2.2 生长速度快菌株的扩培

选择平皿中生长速度快，颜色深的菌落，扩培到茄形瓶中，29 ℃培养，待种子成熟之后，保存于冰箱。

2.2.3 孢子悬浮液的培养

将无菌水加入亚麻刺盘孢霉菌茄形瓶保藏培养基中，用接种环轻轻刮取表层孢子，将洗下的孢子悬浮液置于无菌的盛有玻璃珠的三角瓶内，打散孢子悬浮液约20 min。用血球计数板计算孢子悬浮液的浓度。将计数后的悬浮液于4 ℃冰箱内保藏。尽量保证优化过程中每瓶菌种生长状态一致。

2.2.4 亚麻刺盘孢生长曲线的测定

采用过滤法测定菌体的生物量。取24个容量为500 ml的摇瓶，注明培养时间，分别准确加入100 ml种子培养液，120 ℃灭菌30 min。接种前置无菌室开紫外灯30 min，向每瓶培养基中分别加入1 ml孢子悬浮液，29 ℃、160 rpm/min培养。

从开始培养每隔4 h取2瓶，用恒重的滤纸抽滤菌体，至真空抽不在滴水，弃去滤纸称其重量即为菌体的重量。取2瓶的平均值，以时间为横坐标，菌体量为纵坐标，得到亚麻刺盘孢的生长曲线。

2.2.5 种子液的培养

按种子培养基配方配置种子培养基，分装于500 ml摇瓶中，每瓶装200 ml ， 塞纱布之后包牛皮纸，120 ℃灭菌30 min，冷却。

无菌条件下接种亚麻刺盘孢。

29 ℃、160 rpm/min培养。

2.2.6 投料前培养

按发酵培养基配方配置发酵培养基，分装于500 ml摇瓶中，每瓶装200 ml，塞纱布之后包牛皮纸，120 ℃灭菌30分钟，冷却。待种子液生长到一定间段，且生长良好，无杂菌。在无菌条件下将种子液按10%的量移种到发酵培养基中，置摇床29 ℃180 r/min培养。

2.2.7 投料时间的确定

移种之后，由生长曲线观察，观察菌丝生长良好，镜检无杂菌，分别在对数生长期、稳定前期、稳定中期、稳定后期、衰亡期投料。底物用溶剂（水、甲醇、乙醇、DMF）混合投料。

2.2.8 投料量的确定

分别考察投料量为2 g/l、4 g/l、6 g/l、8 g/l、10 g/l、12 g/l、14 g/l。每个投料量考察2个摇瓶。

2.2.9 投料溶剂及倍率的考察

分别考察溶剂为水、甲醇、乙醇、DMF。选择最优条件后，考察不同倍率投料，

2.2.10 分析方法

发酵液混合均匀，取1 ml发酵液离心，弃去上清，菌丝加入乙酸乙酯，萃取离心取上清检测。检测方法采用高效液相色谱（HPLC）检测DHEA、7α-OH-DHEA、7α，15α-二羟基去氢表雄酮的浓度。

Agilent C18柱，流动相乙腈：水=7：3，柱温30 ℃，检测波长206，进样量为10微升，流速0.5 ml/min.产物计算方法=7α，15α-二羟基去氢表雄酮峰面积/DHEA、7α-OH-DHEA、7α，15α-二羟基去氢表雄酮峰面积。

3 实验结果与分析

3.1 菌种筛选

由于菌种生长时间较长，培养基灭菌之后倒于平皿之时，需要稍微增加平皿中种子培养基的量，以保证培养后期培养基不会因缺水开裂。

菌种筛选过程简单，但工作量大，且不能保证筛选的菌种能够长期稳定的遗传，需要不断的进行筛选，待选择最佳的培养菌种为止。

3.2 菌体生长曲线的测定

制备亚麻刺盘孢孢子悬浮液，接种至种子培养基中摇瓶培养。通过不同培养时间的菌丝体称重，计算生物量，以培养时间为横坐标，菌体量为纵坐标，得到生长曲线如图1所示

由图1观察得到，亚麻刺盘孢生长基本呈现潜伏期、对数期、稳定期和衰亡期的趋势。接种后（0）-（6）h为菌体生长潜伏期，（6）-（18）为对数生长期，（18）-（36）为稳定期，（36）达到最大生物量为31 g/L，之后进入衰亡期。

3.3 投料时间的确定

选择在不同时期投料，取样检测至底物不在消耗为止。以投料时期为横坐标，转化率为纵坐标，如图2所示

如图2所示，选择在对数中后期菌体生长12 h左右投料较佳，转化率可达80%，加底物后继续转化培养至发酵结束。最优选择为生长至12 h投料。

3.4 不同投料溶剂的影响

甾体微生物转化的一个主要问题是底物和产物在水溶液中的溶解度较低，且底物会被析出产物包裹，影响底物和菌种的接触，限制最终的转化。使用溶剂加吐温投料不但可以使底物在水溶液中的溶解度变大，而且溶剂能够增加菌体细胞膜的通透性，使底物和酶系更容易接触。

实验中使用水、甲醇、乙醇、DMF等生产中比较常见的溶剂。空白对照为不加溶剂，以溶剂为横坐标，转化率为纵坐标得到如图3所示。

以不同溶剂投料，可得到最优溶剂为DMF其转化率达81%，这是由于物料在DMF中溶解性大，DMF本身对菌体的毒害性较小，故其转化效果更好，而甲醇与乙醇对菌体有一定的毒害性，会影响菌体生长，水做溶剂时原料溶解性较差不能有效的与菌丝体接触。

3.5 不同投料浓度的影响

选择不同投料量，以投料量为横坐标，转化率为纵坐标作图。得到如图4所示，最优选择为10 g/L，转化率达84%。投料浓度越低转化率越高，但投料浓度过低，降解很严重，最后产物也被降解了，收率比较低。当投料量达到10 g/L时候，通过加入表面活性剂等方法仍然可以达到转化80%以上。

当投料量过大时，底物会抑制菌体生长，且对酶有抑制作用；而且过多底物会在发酵液中结团存在，导致菌丝体无法利用底物；底物转化为产物后析出由于发酵液中底物浓度过高，产物就会在包裹底物形成颗粒，影响转化。

3.6 投料溶剂倍率考察

选择投料溶剂为DMF，依次选择比例为0、1%、2%、3%、4%、5%（按照装液量计算）。每批次2个摇瓶。500ml带刺三口瓶装液量100ml，以溶剂量为横坐标，转化率为纵坐标做图。如图5所示。

最优选择为2%，转化率达83%。虽然DMF的溶解性较大且毒性较小，但当溶剂量过少时仍有部分底物未溶解，造成转化未完全；但溶剂量过大时，也会对菌丝体造成损伤，不利于菌丝体生长及转化。

4 结 语

通过一系列的条件考察，我们最终以葡糖糖30，玉米浆10，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钾2，硫酸镁0.244，泡敌适量（不起泡沫即可）为培养基，最优培养条件为：种子培养条件29℃，

160 rpm/min，发酵培养条件29 ℃，180 rpm/min，最优转化条件为：种子培养30～36 h，发酵培养为10%移种量培养12～18 h，生长良好，无杂菌使用2倍DMF投料。最终通过亚麻刺盘孢转化DHEA生成目标产物转化率可达80%以上。且工艺稳定，通过比例放大验证工艺可行，适用于大规模工业化生产。

参考文献：

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