核磁共振氢谱对6群肺炎链球菌荚膜多糖的结构分析

陈琼　许美凤　余勇

[摘要] 目的 对6群型肺炎链球菌荚膜多糖进行结构分析。 方法 应用分子生物学方法将6群肺炎链球菌分为6A型、6B型、6C型和6D型，提纯其荚膜多糖，并采用核磁共振氢谱（1H NMR）对6群肺炎链球菌荚膜多糖的结构进行分析，比较6A型、6B型、6C型和6D型多糖结构1H NMR谱的端基质子区和环质子区化学位移的差异。 结果 6A型谱图中，三个特征质子峰化学位移值分别为？啄5.62、？啄5.13和？啄5.05；6C型谱图中，三个特征质子峰化学位移值分别为？啄5.59、？啄5.13和？啄5.05；6B型谱图中，三个特征质子峰化学位移分别为？啄5.62、？啄5.17和？啄5.15；6D型谱图中，三个特征质子峰化学位移分别为？啄5.59、？啄5.17和？啄5.15。6A、6B、6C和6D型的环质子区（？啄4.40～3.30）化学位移表现出不同的位移特性。 结论 获得6A型、6B型、6C型和6D型肺炎链球菌荚膜多糖1H NMR谱图，其端基质子区和环质子区化学位移存在差异，为荚膜多糖质量控制提供基础。

[关键词] 肺炎链球菌荚膜多糖；核磁共振氢谱；端基质子；环质子；化学位移

[中图分类号] R914 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（b）-0016-04

[Abstract] Objective To analyze the structures of the capsular polysaccharides from streptococcus pneumoniae serogroup 6. Methods Serotypes of streptococcus pneumonia were determinated as 6A， 6B， 6C and 6D using the molecular biological technologies， then the capsular polysaccharides were extracted and the structures were analyzed by 1H nuclear magnetic resonance （NMR）. The chemical shifts of anomeric proton regions and ring proton regions of 1H NMR spectrums were analyzed and compared among different serotypes of capsular polysaccharides. Results The chemical shifts of all characteristic protons peaks of the pneumococcal capsular polysaccharides serotype 6A were ？啄5.62， ？啄5.13 and ？啄5.05 separately； serotype 6C were ？啄5.59， ？啄5.13， and ？啄5.05； serotype 6B were ？啄5.62， ？啄5.17 and ？啄5.15； serotype 6D were ？啄5.59， ？啄5.17， and ？啄5.15. The chemical shifts of ring proton regions （？啄4.40-3.30） of 4 serotypes were different. Conclusion The 1H NMR spectrums of pneumococcal capsular polysaccharides serotype 6A， 6B， 6C and 6D were determinated， and the chemical shifts of anomeric proton regions and ring proton regions were different in each serotype. It provides data for the quality control of different capsular polysaccharide.

[Key words] Pneumococcal capsular polysaccharide； 1H NMR； Anomeric proton； Ring proton； Chemical shift

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是严重威胁人类健康的常见病原菌之一，能够引起肺炎、急性呼吸道感染、中耳炎、脑膜炎和菌血症等侵袭性和非侵袭性疾病。根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）报道，在发展中国家每年约有160万例死于肺炎链球菌感染，其中100万例是<5岁的儿童[1]。

肺炎链球菌荚膜多糖既是毒力因子又是保护性抗原，已成功用来制备肺炎链球菌荚膜多糖疫苗及多糖蛋白结合疫苗。6A和6B型肺炎链球菌作为导致侵袭性链球菌感染的常见血清型，23价肺炎球菌多糖疫苗和7价肺炎球菌多糖疫苗中均包含6B型荚膜多糖，10价和13价肺炎球菌结合疫苗中均包含6A和6B型荚膜多糖。随着分子生物学技术的进展，对荚膜多糖合成相关基因（cps loci）的深入研究，发现6群肺炎链球菌可分为6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G和6H型[2-7]。

核磁共振波谱（Nuclear magnetic resonance，NMR）能够直接分析肺炎球菌多糖的化学结构、取代基类型及其位置和数目，分析不同多糖结构之间的细微差异，鉴定不同血清型的荚膜多糖。目前NMR 波谱已经是《欧洲药典》推荐草案和WHO 推荐的多糖质量控制方法[8-12]。1979年采用NMR技术对6A型和6B型肺炎链球菌荚膜多糖进行结构分析[13]，2012年确定了新发现的6C型荚膜多糖结构[14]。

本研究根据6群荚膜多糖合成相关基因序列和文献报道[15]，应用分子生物学技术在分子水平上鉴定6群肺炎链球菌的血清型，并且根据NMR可通过对多糖分子特异基团上特征质子的检测，获得6A、6B、6C和6D型肺炎链球菌荚膜多糖1H NMR图谱，为肺炎链球菌荚膜多糖的质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

6群肺炎链球菌由中国医学细菌保藏管理中心保藏提供。

1.2 试剂与仪器

Varian Unity Inova 600 型超导脉冲傅里叶变换NMR 谱仪购自美国Varian公司；氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均购自中国医药集团化学试剂有限公司；重水、3-（三甲基硅）丙酸-D4钠盐、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾购自Fluka公司；氘代试剂：以100 mmol/L pH值7.0磷酸盐缓冲液（PBS）溶解3-（三甲基硅）丙酸-D4钠盐至1 mmol/L，4℃保存备用。重水（D2O，99.8%氘代）购自Sigma-Aldrich公司，内标物2，2，3，3-氘代三甲基甲硅烷基丙酸钠（TSP）购自加拿大Merck 公司。配制内标物TSP浓度为1 mmol/L的重水溶液待用。

1.3 6群肺炎链球菌的血清型鉴定

对6群肺炎链球菌的cpsD、wciN和wciP基因进行扩增测序，以及对其序列进行BLAST比对，将6群肺炎链球菌鉴定为6A、6B、6C和6D型[16]。

1.4 荚膜多糖的提纯

6A、6B、6C和6D型肺炎链球菌三级发酵后，脱氧胆酸钠杀菌后离心收集上清，经100 kD膜包超滤浓缩1/10～1/8，加入预冷95%乙醇至终浓度20%～30%，离心收集上清，加入预冷95%乙醇至终浓度为50%～80%，离心收集沉淀，经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后，抽干即为粗糖。将粗糖溶解于中性醋酸钠溶液中进行冷酚萃取，离心收集上清，经100 kD膜包超滤去除苯酚，加入预冷95%乙醇至终浓度20%～30%，离心收集上清，经50 kD膜包超滤去除核酸，加入预冷95%乙醇至终浓度为50%～80%，离心收集沉淀，经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤抽干后分别获得6A、6B、6C和6D型荚膜多糖。

1.5 NMR样品的制备

分别称取4种血清型冻干荚膜多糖约3 mg，以0.6 mL含1 mmol/L TSP的重水溶液溶解，放置4℃冰箱中过夜使多糖完全溶解，涡旋混匀，以7200 r/min离心10 min，最后将样品转移到5 mm核磁管中待测。

1.6 NMR数据采集与处理样品

1H NMR谱图由Varian Unity Inova 600型NMR谱仪在40℃下采集得到，实验采用PRESAT单脉冲序列，主要的实验参数为谱宽7200 Hz，弛豫延迟时间2 s，采样点数64 k，累加次数64次。所有采集得到的自由感应衰减（FID）信号经过傅里叶变换转换为NMR图谱，线宽因子为0.1 Hz，经相位调整、基线校正，并以TSP的谱峰为化学位移参考峰，设为？啄0。

2 结果

6A、6B、6C和6D型荚膜多糖的1H NMR谱图见图1。从图1可见，6群肺炎链球菌荚膜多糖的端基质子区（？啄5.41～5.00）比较接近。6A型谱图中，？啄5.62为半乳糖端基质子的化学位移，？啄5.13为葡萄糖端基质子的化学位移，？啄5.05为鼠李糖端基质子的化学位移；6C型谱图中，？啄5.59为葡萄糖端基质子的化学位移，？啄5.13为葡萄糖端基质子的化学位移，？啄5.05为鼠李糖端基质子的化学位移；6B型谱图中，？啄5.62为半乳糖端基质子的化学位移，？啄5.17为鼠李糖端基质子的化学位移，？啄5.15为葡萄糖端基质子的化学位移；6D型谱图中，？啄5.59为葡萄糖端基质子的化学位移，？啄5.17为鼠李糖端基质子的化学位移，？啄5.15为葡萄糖端基质子的化学位移。6A、6B、6C和6D型的环质子区（？啄4.40～3.30）化学位移表现出不同的位移特性。

3 讨论

肺炎链球菌是具有荚膜结构的革兰阳性菌，根据荚膜多糖结构不同，至少可以分为93个血清型[4]。特异性的荚膜多糖既是肺炎链球菌的毒力因子也是保护性抗原。随着分子生物学手段在医学细菌研究中的深入应用，2007年和2009年分别从原6A和6B型中发现了6C型和6D型。2013年又分别发现了6E、6F、6G型，2015年发现了6H型。

2012年应用核磁共振技术对6C型肺炎链球菌荚膜多糖进行解结构分析，结果与2007年发现6C型时所推测的结构完全一致[14]。2013年在发现6F和6G型的文献报道中，有6A、6B、6C、6D、6F和6G型荚膜多糖1H NMR端基质子区，其化学位移与本研究中的数据稍有差异，如6A型谱图中3个端基质子峰分别为？啄5.60、？啄5.10和？啄5.02，6C型谱图中3个端基质子峰分别为？啄5.57、？啄5.10和？啄5.02，6B型谱图中3个端基质子峰分别为？啄5.56、？啄5.14和？啄5.10，6D型谱图中3个端基质子峰分别为？啄5.56、？啄5.14和？啄5.11[17]。目前无6D型荚膜多糖1H NMR谱发表。

1H NMR技术分析多糖结构因其简捷、方便、重现性好、分辨率高等优点越来越多的应用于肺炎球菌多糖疫苗的质量控制。目前普遍采用1H NMR端基质子区作为肺炎链球菌荚膜多糖血清型鉴定的“指纹”鉴定区。6A型和6C型、6B型和6D型，其端基质子峰差异比较小，如果NMR数据采集条件不同，可能会导致无法正确鉴定其血清型。本研究比较此四种血清型的1H NMR谱图，为正确鉴定荚膜多糖血清型提供基础。

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（收稿日期：2016-07-10 本文编辑：赵鲁枫）