不同方案和移植前激素对移植解冻后生长胚胎妊娠结局的影响*

刘芳，赵杰，陈秀娟，托娅，梁琳，王萨仁

（内蒙古医科大学附属医院生殖中心，内蒙古 呼和浩特 010059）

不同方案和移植前激素对移植解冻后生长胚胎妊娠结局的影响*

刘芳，赵杰，陈秀娟，托娅，梁琳，王萨仁

（内蒙古医科大学附属医院生殖中心，内蒙古 呼和浩特 010059）

目的探讨在冷冻胚胎复苏移植周期中，解冻后过夜培养均生长的胚胎在两种内膜准备方案移植，影响妊娠结局的因素分析。方法选取在该中心行冻融胚胎移植的患者305例，359个周期的病历资料为研究对象，并对其进行回顾性分析。冷冻胚胎解冻后观察胚胎生长情况，其中胚胎均有不同程度生长为生长组（191例），胚胎均未见生长的为未生长组（48例），胚胎既有生长的又含有未生长的为生长混合组（120例）。其中生长组按照不同内膜准备方案将其分类，分为自然周期组（90例）和激素替代治疗周期组（101例）。比较各组的妊娠率、种植率、流产率、活产率的差别。结果生长组种植率为26.57%，高于生长混合组的16.78%（χ2=9.135，P=0.002）。自然周期组和激素替代治疗周期组移植前雌二醇、孕酮比较，差异有统计学意义（t=12.392和3.667，P=0.000和0.006）。在临床助孕结局方面，自然周期组和激素替代治疗周期组的临床妊娠率、种植率、异位妊娠率等比较，差异无统计学意义；而两组流产率、活产率比较，差异有统计学意义（χ2=3.949和5.991，P=0.044和0.020）。结论胚胎解冻后经过夜培养，有卵裂球细胞生长的胚胎能够获得较高的种植率和妊娠率，且移植均生长发育的胚胎在自然周期方案有较好的妊娠结局。

冻融胚胎移植；自然周期；激素替代周期；活产率

辅助生殖技术中冷冻胚胎移植（frozenthawed embryo transfer，FET）已成为常规技术之一。随着超促排卵技术、冷冻胚胎复苏技术及移植技术水平的提高，FET治疗不孕逐渐成为辅助生殖医学的主流方法[1]。冻融胚胎移植与“新鲜”周期移植相比，可以降低成本，而且用时短、操作简单[2]。目前，提高冻融胚胎移植的妊娠结局是研究的焦点。如今应用较广泛的玻璃化冷冻技术，可以防止冰晶体的形成，有效减少细胞损伤，使胚胎的生殖潜力与新鲜胚胎相似。但在移植解冻后过夜培养均有生长发育的胚胎，某些因素仍影响胚胎着床，如子宫内膜过薄或者过厚，移植前日激素的高、低等[3]。就上述问题，本研究采用回顾性分析法，选取2012年5月-2013年10月在内蒙古医科大学附属医院生殖医学中心接受FET的305例患者的病历资料为研究对象，比较解冻后过夜培养均发育生长的胚胎其自然周期和激素替代治疗（hormone replacement therapy，HRT）周期两种内膜准备方案对FET妊娠结局的影响。

1 资料与方法

1.1 病例资料

选取2012年5月-2013年10月在本中心行冻融胚胎移植的患者305例，共359个周期，不育原因为输卵管阻塞、排卵障碍、子宫内膜异位症、男方少弱精子或无精子症等。①控制性超促排卵：新鲜周期根据患者情况选择超长方案、长方案、拮抗剂方案、微刺激方案，经阴道在超声引导下穿刺抽吸取卵手术，取卵后行体外受精/胞浆内单精子注射及胚胎培养。②冷冻胚胎选择：胚胎培养至取卵后第3天，按选择取卵后第2天细胞数≥2个，第3天细胞数≥4个；碎片≤50%的胚胎行玻璃化冷冻。

1.2 实验方法及观察指标

采用玻璃化冷冻/快速解冻的方法。解冻后的胚胎检查透明带的完整性、卵浆的透亮程度，如＞50%卵裂球受损，则视为死亡[4]。选用完整和部分受损的存活胚胎，过夜培养观察胚胎是否生长，将胚胎情况进行记录。根据其生长情况分为3组：所移植胚胎均有不同程度生长的为生长组（191例），所移植胚胎均未见生长的为未生长组（48例），所移植胚胎既有生长的胚胎又有未生长胚胎的为生长混合组（120例）。

1.3 分组及相应子宫内膜准备方案

按照不同的子宫内膜准备方案，为排除因不同发育阶段的胚胎冷冻和冷冻方法对妊娠结局的影响[5]，选取玻璃化冷冻胚胎解冻后过夜培养后均有生长发育的共191个周期进一步分析。将纳入研究的周期根据内膜分为自然周期组（90例），HRT周期组（101例）。自然周期组受试者方案为：对于月经规律者，于月经周期第10～12天开始超声监测排卵，同时配合使用排卵试纸，当优势卵泡直径≥16～18 mm时，尿LH（+），肌内注射人绒毛膜促性腺素（珠海丽珠制药公司）5 000～10 000 IU，以诱导排卵。排卵后当天开始使用注射用黄体酮20 mg、1次/d，3 d后胚胎移植。HRT周期组采雌、孕激素方案：于月经第2天开始服用戊酸雌二醇片2 mg/d，2次/d，7 d后超声监测子宫内膜厚度，根据内膜厚度调整雌激素剂量，最大剂量为6 mg/次，2次/d，当子宫内膜厚度≥8 mm时，加用孕激素类药物黄体酮40～60 mg，于给予黄体酮的第5天胚胎移植。移植前1 d所有患者测定血清雌二醇（Estradiol，E2）和孕酮（Progesterone，P）水平，并根据血清孕酮水平调整黄体酮的剂量[6]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，3组间比较用单因素方差分析，两组间比较用独立样本t检验，计数资料以率表示，用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胚胎生长情况对妊娠结局的影响

共解冻移植356个周期，无取消周期；解冻胚胎843个，存活798个，存活率为94.66%；移植胚胎778个，种植175个，种植率为22.49%；妊娠145个周期，平均妊娠率为40.38%。过夜培养后，生长组191个周期，种植率为26.57%，妊娠率为46.07%，未生长组48个周期，妊娠率为33.33%，种植率为17.65%；生长混合组120个周期，妊娠率为34.16%，种植率为16.78%。3组年龄、获卵数、移植数比较，经方差分析，差异无统计学意义（见表1）。3组妊娠率、种植率比较，经χ2检验，差异无统计学意义（P＜0.05）。生长组与生长混合组种植率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=9.135，P=0.002），生长组高于生长混合组（见表2）。

表1 按胚胎生长情况进行分组的基本资料

表2 胚胎生长情况对妊娠结局的影响例（%）

2.2 不同子宫内膜准备方案移植解冻后生长胚胎的比较

过夜培养胚胎均生长的共191个周期，其中自然周期组90个，HRT周期组101个。两组年龄、不孕年限、内膜厚度、移植胚胎数比较，经独立样本t检验，差异无统计学意义；两组移植前E2、P水平比较，经独立样本t检验，差异有统计学意义（t=12.392和3.667，P=0.000和0.006），HRT周期组移植前E2、P水平高于自然周期组；两组D2内膜厚度比较，经独立样本t检验，差异有统计学意义（t=4.228，P=0.000），自然周期组D2内膜厚度高于HRT周期组。两组流产率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=3.949，P=0.044），HRT周期组流产率高于自然周期组；两组活产率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2= 5.991，P=0.020），自然周期组活产率高于HRT周期组（见表3）。

表3 不同子宫内膜准备方案移植解冻后生长胚胎的比较

3 讨论

冻融胚胎移植临床妊娠主要取决于解冻后胚胎的发育潜能、子宫内膜的容受性及相互作用[7]。子宫内膜着床窗口的形成除受卵巢激素控制外，胚胎也起重要作用。子宫内膜在着床开始，分泌细胞因子，同时胚胎也分泌某种或多种细胞因子，诱导子宫内膜的成熟，促进胚胎与子宫内膜的附着[8]。提前解冻胚胎，过夜培养后观察复苏后胚胎是否继续生长，对评价胚胎种植潜能有重要意义。van DER ELST等[9]认为，复苏后卵裂球继续发育可能对于着床时胚胎与子宫内膜的同步性更有利。此外，LAVERGE等[10]对复苏后培养未生长的胚胎进行荧光原位杂交，发现这些胚胎表现染色体异常，包括单倍体、三倍体、四倍体和嵌合体的发生，仅20%左右的为正常的二倍体，因此建议复苏后培养，观察胚胎生长情况，并建议不移植无进一步生长的胚胎。本研究发现，胚胎解冻后过夜培养，所移植胚胎均有生长的生长组种植率高于未生长组及生长混合组，因此在排除胚胎质量差异的情况下，移植生长组胚胎分析子宫内膜与胚胎发育的同步性，即冻融胚胎的移植时机成为最后的关键。子宫内膜容受性是子宫内膜能允许胚胎着床的能力，是特定时期的一种状态，即着床窗期。在这特定的时期，子宫内膜在雌、孕激素作用下发生一系列与胚胎发育同步、有利于胚胎着床的形态结构变化，对胚胎具有容受性，能使胚胎顺利着床[11-12]。有研究认为，子宫内膜是雌激素、孕激素作用最直接的靶器官，合适的E2、P是刺激着床前子宫内膜呈容受状态的重要因素[13]。本研究中，自然周期与HRT周期移植前雌二醇和孕酮值比较，差异有统计学意义，HRT周期高于自然周期，不同的内膜准备中足够的雌激素、孕酮摄入是获得正常分泌期内膜所必需的，也是内膜准备必不可少的，但两种内膜准备所需激素有不同，所以移植前应检测各自雌、孕激素，及时调整用药。

选择适当子宫内膜准备方案是较重要，尽管目前报道关于最佳的内膜准备方案仍有争议[14]，关于冻融胚胎移植内膜准备妊娠结局的研究缺乏共识。很多研究认为，NC周期与HRT周期临床妊娠率相当[15]。也有些作者建议，HRT周期较优势，可以调整E2、P，控制性强；另一些学者研究认为，使用激素替代周期持续的妊娠率需要进一步更大的前瞻性研究证实[13]，但子宫内膜的准备应与胚胎发育同步。在本研究中，笔者比较两种子宫内膜准备的妊娠结局，虽然替代周期的妊娠率高于自然周期，但流产率较高，而最终活产率低于自然周期（P＜0.05），提示自然周期方案的冷冻胚胎移植最终妊娠结局较好，有较高的活产率，这也是助孕最终所需要达到的目标。

总之，冻融胚胎移植确实增加患者一次取卵的妊娠率，使患者累计妊娠率提高，根据患者情况可采用个体化方案，严格控制冷冻、解冻操作过程的每一细节，以获得高质量的胚胎。同时，移植前日恰当的雌孕激素水平是评价是否获得良好治疗结局的关键。对冻融胚胎移植结局进行预测的研究，能为生殖医学带来更大的扩展空间。

[1]PINBORG A.To transfer fresh or thawed embryos[J].Semin Reprod Med,2012,30(3):230-235.

[2]MOUZON J,GOOSSENS V,BHATTACHARYA S,et al.Assisted reproductive technology in Europe,2007:results generated from European registers by ESHRE[J].Hum Reprod,2012,27: 954-966.

[3]DONG Z,SUN L,ZHANG H W,et al.The frozen thawed embryo transfer timing determined by serum progesterone level:a retrospective follow-up study[J].European Journal of Obstetrics Gynecology and Reproductive Biology,2014,1 81:210-213.

[4]BRUCE S,SAID T,FOREST C,et al.Evidence of impaired endometrial after ovarian stimulation for in vitro fertilization[J]. Fertility and Sterilit,2011,96(2):344-349.

[5]林洪波,李蓉,钱卫平.冷冻胚胎移植周期中不同内膜准备方案对助孕结局的影响[J].中华妇幼临床医学杂志,2014,10(4):457-460.

[6]郭慧,龚斐,卢光磅.不同解冻和移植时间的冻融胚胎成功率分析[J].生殖医学杂志,2012,22(1):64-66.

[7]JIN R T,TONG X H,WU L M,et a1.Extended culture of vitrified waimed embryos in day 3 embryo transfer cycles:a randomized controlled pilot study[J].Reproductive Bio Medcine Online, 2013,26:384-392.

[8]PARK C B,DUFORT D.Nodal expression in the uterus of the mouse is regulated by the embryo and correlates with implantation[J].Biol Reprod,2011,84(6):1103-1110.

[9]van DER ELST J,van DEN ABBEEL E,VITRIER S,et al. Selective transfer of cryopreserved human embryos with further cleavage after thawing increases delivery and implantation rates[J]. Hum Reprod,1997,12:1513-1521.

[10]LAVERGE H,van DER ELST J,de SUTTER P,et al.Fluorescent insitu hybridization on human embryos showing cleavage arrest after freezingt and thawing[J].Hum Reprod,1998,13: 425-429.

[11]李冬梅,黎淑贞,陈希曦,等.两种内膜准备方案不同移植时间对冻融胚胎临床结局的影响[J].生殖医学杂志,2013,22(6):451-454.

[12]KIM C H,LEE Y J,LEE K H,et al.The effect of luteal phase progesterone supplementation on natural frozen-thawed embryo transfer cycles[J].Obstet Gynecol Sci,2014,57(4):291-296.

[13]LEE V C Y,LI R H W,CHAI J,et al.Effect of preovulatory prog-esterone elevation and duration of progesterone elevation on the pregnancy rate of frozen thawed embryo transfer in natural cycles[J].Fertility and Sterilit,2014,101(5):1288-1293.

[14]LEVRON J,YERUSHALMI G M,BRENGAUZ M,et al.Comparison between two protocols for thawed embryo transfer:natural cycle versus exogenous hormone replacement[J].Gynecol Endocr-Inol,2014,30(7):494-497.

[15]范晓玲,芦瑞萍,胡蓉,等.不孕症患者冻融胚胎移植日血清E2、P水平及P/E2对临床妊娠率的影响[J].山东医药,2015,55(15): 54-55.

（童颖丹 编辑）

Impact of different programs and hormones on pregnancy outcome in advanced frozen-thawed embryos transfer cycles*

Fang Liu,Jie Zhao,Xiu-juan Chen,Ya Tuo,Lin Liang,Sa-ren Wang
(Reproductive Center,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot,Inner Mongolia 010059,China)

Objective To analyze the impact of resumption growth overnight culture and two kinds of endometrial preparation for growth of embryos on the outcome of frozen-thawed embryos transfer(FET). Methods A total of 305 cases transfered with frozen-thawed embryos in the center were enrolled into the study.The medical records of 359 cycles were studied and analyzed retrospectively.The growth of the embryos were observed after thawing.The cycles were divided into three groups.In group A1(n=191),the embryos continued to grow after overnight culture.In group A2(n=48),the embryos did not continue to cleave after overnight culture.In group A3(n=120),there were embryos with and without further cleavage. According to different endometrial preparation programs the group A1 was grouped into the natural cycle group(n=90)and hormone replacement therapy(HRT)group(n=101).The planting rate,pregnancy rate, abortion rate and live-birth rate were compared between the groups.Results The embryo planting rate of the group A1(26.57%)was significantly higher than that(16.78%)of the group A3(χ2=9.135,P=0.002).The estradiol(E2)and progesterone(P)levels before transplantation were statistically different between the natural cycle and HRT groups(t=12.392 and 3.667,P=0.000 and 0.006).The pregnancy rate,planting rate orectopic pregnancy rate had no statistical significant difference between the two groups;while the rates of abortion and live-birth had significant difference between the natural cycle group and the HRT group(χ2= 3.949 and 5.991,P=0.044 and 0.020).Conclusions After overnight culture of thawed embryos,high pregnancy rate and planting rate can be obtained in the embryos with blastomere growth.Post-planting growing embryos have good pregnancy outcomes in natural cycle.

frozen embryo transfer;natural cycle;hormone replacement cycle;live-birth rate

R714.8

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.019

1005-8982（2016）23-0095-04

2016-02-17

内蒙古医科大学科技百万工程（No：YKD2015KJBW023）；内蒙古自治区高等学校科学研究项目（No：NJZY16118）

赵杰，E-mail：zhaojie981224@163.com