再造烟叶浓白水中蛋白质提取工艺的优化研究

卫 青，吴平艳，段 孟，张振强，刘维涓 (云南瑞升烟草技术(集团)有限公司，云南昆明 650106)



再造烟叶浓白水中蛋白质提取工艺的优化研究

卫 青，吴平艳，段 孟，张振强，刘维涓*(云南瑞升烟草技术(集团)有限公司，云南昆明 650106)

[目的]研究薄片厂抄造段浓白水中蛋白质回收工艺，减少废水中有机物对环境造成的污染，促进环境与经济可持续发展。[方法]分析pH对提取再造烟叶浓白水中可溶性蛋白质的影响，确定适宜工艺参数。[结果] 从再造烟叶浓白水中提取可溶性蛋白质的最佳工艺参数为酸溶pH 3.5，碱沉pH 8.0。[结论] 选取适宜的pH可对高效提取浓白水中蛋白质起到决定性作用。

再造烟叶；抄造段；浓白水；提取；蛋白质

造纸法再造烟叶生产过程中耗水量很大，据统计，每生产1 t再造烟叶产品产生废水量在70 m3以上。因其具有色度高、成分杂、降解难的特点，会对周边环境造成严重危害[1-3]。莫立焕等率先对造纸法烟草薄片产生的废水进行了深度研究，发现废水中含有木质素、纤维素、果胶、多糖、可溶性蛋白质等有机物[4]，其中蛋白质的含量最为丰富。研究表明，烟草中蛋白质含有各种氨基酸，其含量极其丰富、均衡，经精密加工可获得生物活性肽、氨基酸等附加值高的产品[5-6]。如果能够将再造烟叶废水中高价值成分——蛋白质进行回收利用，不仅有助于保护自然环境，减少资源浪费，更重要的是目前动物蛋白生产供应不足，无法满足人们的需求，回收利用优质植物蛋白很可能是一条可行的解决途径。

迄今为止有关造纸法再造烟叶废水方面的研究，均围绕废水净化处理开展工作[7-8]，有关烟草蛋白提取方面的研究，均是以残次烟叶为原料进行的，并且提取过程繁琐，难以实现规模化生产[9-10]。笔者选取再造烟叶抄造成型网布下的浓白水作为研究对象，提取其中烟草蛋白，以减少生产废水中有机物对环境造成的污染，促进薄片行业环境与经济的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1原料及主要试剂。白水，由云南某薄片厂提供；NaOH，西陇化工股份有限公司；H3PO4，分析纯，西陇化工股份有限公司。

1.1.2主要仪器。SHZ-D(Ⅲ)型循环式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；PHS-3C型精密pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；centrifuge 5804R型离心机，Eppendorf；LC-162型冰箱，海尔；MS 204S型电子天平，Switzerland。

1.2 方法

1.2.1烟草蛋白质沉淀。用磷酸将白水调至pH约3.0，静置一段时间。使用NaOH调节溶液至pH约8.0，在4 ℃环境下静置3.0 h。若产生沉淀，将沉淀离心分离，对沉淀成分进行检测。

1.2.2烟草蛋白质沉淀的最佳pH。将白水分成5份，用磷酸分别调pH为2.5、3.0、3.5、4.0、5.0，静置一段时间，使用NaOH调节溶液pH约8.0，在4 ℃环境下静置3.0 h，将沉淀离心分离，分别称量出沉淀物的重量。不同pH白水样品各设6次重复。

将白水分成5份，用磷酸将其均调至pH约3.0，静置一段时间，使用NaOH调节溶液pH分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，在4 ℃下静置3.0 h，将沉淀离心分离，分别称量出沉淀物的重量。不同pH白水样品各设6次重复。

2 结果与分析

2.1 烟草蛋白质的沉淀将试验得到的白色沉淀物送至云南同创检测技术股份有限公司进行成分检测，得到沉淀主要成分为蛋白质。由此表明，试验从烟草浆料中成功提取到了蛋白质(沉淀为水溶性蛋白质)。试验提取得到的烟草蛋白质沉淀量是否会随pH变化而变化，需要对不同pH下的试验结果进行分析。

2.2 白水中蛋白质提取的最佳pH

2.2.1酸溶最佳pH。酸溶的最佳pH测定结果如表1所示。蛋白质沉淀质量随不同pH酸溶的变化趋势如图1所示。从表1、图1可以看出，随酸溶pH的变化，沉淀质量随之变化，这是由于不同的pH酸溶程度不同，因此蛋白质沉淀溶解量不同(图2)。当pH达到3.5时，沉淀质量为3.252 3 g，达到最大值，比沉淀最低值3.200 6 g高出1.6%；当pH为4.0、5.0时，由于蛋白质酸溶并不彻底，导致沉淀质量随pH的增大而减少，其变化趋势如图1所示。

表1 各样品不同酸溶pH下的蛋白质沉淀质量

图1 蛋白质沉淀质量随不同酸溶pH的变化趋势

图2 不同pH酸溶的蛋白质沉淀

根据方差分析结果得知，F>F-crit = 5.317 655，P<0.01，表明模型达到极显著，酸溶的pH对蛋白质沉淀量具有极显著的影响，烟草蛋白的沉淀量随pH的降低而增大，直至达到沉淀量的最大值。

利用回归分析，对酸溶pH与烟草蛋白沉淀量的关系进行分析，并对回归方程进行预估，取R2最大的方程，得到回归方程为y=0.128 3x4-1.904 5x3+10.383x2-24.642x+24.705，R2值为1(拟合度很高)，预估拟合曲线如图3所示。可以看出，酸溶pH与烟草蛋白沉淀量呈显著负相关。

图3 酸性条件下烟草蛋白沉淀量的拟合曲线

2.2.2碱沉最佳pH。碱沉的最佳pH测定结果，参见表2所示。蛋白质的沉淀随不同pH碱沉的变化趋势如图4所示。由表2、图4可以看出，不同pH碱沉后的蛋白质沉淀量不同，这是由于pH不同，导致碱沉的程度不同(图5)，如pH为7.0时，碱沉并不彻底，蛋白质沉淀量少。当pH达到8.0时，沉淀物达到最大值为2.326 3 g，比pH为7.0对应的沉淀量1.564 8 g高出48.66%；而pH小于8.0时，由于碱沉不彻底，沉淀量随pH减小而减少，其变化趋势如图4所示。

表2 各样品不同pH碱沉下的蛋白质沉淀质量

图4 蛋白质沉淀质量随不同碱沉pH的变化趋势

图5 不同pH碱沉的蛋白质沉淀

根据方差分析结果得知，F>F-crit = 5.317 655，P<0.01，表明模型达到极显著，碱沉的pH对蛋白质沉淀量具有极显著的影响，沉淀量随pH增大而增加，直至达到沉淀量的最大值。

利用回归分析，对碱沉pH与烟草蛋白质沉淀量的关系进行分析，并对回归方程进行预估，取R2最大的方程，得到回归方程为y=-0.346 2x2+5.904 9x-22.798，R2值为0.987 4(拟合度很高)，预估拟合曲线如图6。可以得出，碱沉pH与烟草蛋白沉淀量呈显著正相关。

图6 碱性条件下烟草蛋白质沉淀量的拟合曲线

3 结论与讨论

早期研究表明[11-12]，烟草中的蛋白质分为可溶性蛋白和不溶性蛋白。可溶性蛋白的1/2左右是叶绿体蛋白(Fraction Ⅰ protein，FⅠ蛋白)，另外1/2为其他可溶性蛋白质的复合物(Fraction Ⅱ protein，FⅡ蛋白)。FⅠ蛋白(Rubisco蛋白)只溶解于底物1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)或高浓度盐(如NaCI)溶液中；FⅡ蛋白因其为混合物，不能结晶，但可以被丙酮萃取和水洗提纯，不含色素和酚类等杂质的性质。依据两者不同的理化性质及白色沉淀物性状，可推断薄片生产过程中的程中的浓白水含有的烟草蛋白应归为FⅡ蛋白。该试验表明，可通过酸碱工艺从白水中提取出可溶性蛋白质，进行烟草蛋白的回收利用。当碱沉pH一定，酸溶pH > 3.5时，烟草蛋白沉淀量随着酸溶pH的减小而增大；当酸溶pH一定，碱沉pH < 8.0时，烟草蛋白质沉淀量会随碱沉pH的增大而增大；在pH 3.5时进行酸溶，同时，pH 8.0时进行碱沉，烟草蛋白质沉淀量最大。中性偏碱可获得蛋白质量最大，这一结果同Platis等试验结论一致。中性偏碱的环境下，蛋白质提取率较高，这可能与烟草蛋白的等电点pI>7有关[13]。

总之，烟草蛋白是一种极具利用潜力和发展前景的植物蛋白资源，深入研究开发这种资源不仅有助于提高烟草的综合利用价值，还可促进烟草行业的可持续发展。尤其对于造纸法再造烟叶生产企业而言，由生产废水中提取烟草蛋白既保护了自然环境，减轻了对周边环境的污染，又可促进产业结构调整，增加企业收入，有较好的应用前景。

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Optimization of Protein Extraction Technology of Concentrated White Water of Reconstituted Tobacco

WEI Qing, WU Ping-yan, DUAN Meng, LIU Wei-juan*et al (Yunnan Reascend Tobacco Technology (Group) Co., Ltd., Kunming, Yunnan 650106)

[Objective] To research the protein extraction technology in concentrated white water in chip factory, and to alleviate the environmental pollution caused by organic compounds, and to promote sustainable environment and economic development. [Method] Effects of pH value on soluble protein in concentrated white water were researched. [Result] The optimal technology parameter for extracted soluble protein was as follows: acid extraction pH 3.5, alkali precipitation pH 8.0. [Conclusion] A suitable pH value plays a decisive role in efficient protein extraction of concentrated white water.

Reconstituted tobacco; Papermaking; Concentrated white water; Extraction; Protein

卫青(1979- )，男，云南石屏人，高级工程师，硕士，从事再造烟叶技术研究。*通讯作者，研究员，博士，从事再造烟叶技术研究及产品开发、推广、应用。

2016-09-09

S 572

A

0517-6611(2016)30-0067-03