TSA对发育期大鼠癫痫后脑损伤的保护作用及其机制

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(1.南华大学附属第二医院功能检查科，湖南 衡阳 421001；2.南华大学附属第二医院儿科)

·基础医学·

TSA对发育期大鼠癫痫后脑损伤的保护作用及其机制

黄湘壹1,胡擎鹏2*，冯伟2，刘剑峰2

(1.南华大学附属第二医院功能检查科，湖南 衡阳 421001；2.南华大学附属第二医院儿科)

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑素A(TSA)在癫痫后脑损伤发病中的作用及其机制。

方法将32只雄性SD大鼠随机分为4组：对照组、海人酸(KA)组、小剂量TSA干预组(0.03 mg/kg)及大剂量TSA干预组(0.1 mg/kg)组,通过腹腔注射海人酸(KA)制作发育期大鼠癫痫模型,TSA于KA诱导癫痫前2 h腹腔注射给药，评估惊厥发作的等级及记录惊厥的潜伏期。癫痫后24 h处死大鼠，HE染色观察脑组织病理变化；TUNEL染色检测大鼠海马神经元细胞凋亡；CD68染色检测活化的小胶质细胞；Western blot检测IL-1β和TNF-α蛋白的表达。结果KA组均达到Ⅳ～V级惊厥发作，而TSA干预组能减轻惊厥发作的等级和延长惊厥的潜伏期。HE染色可见KA组明显的神经元凋亡及细胞水肿，伴有较多的炎症细胞浸润，而TSA干预组能减轻神经元凋亡及细胞水肿，同时减少炎症细胞浸润。与对照组比较，KA组神经元凋亡数、小胶质细胞活化数及炎症因子的表达均显著增加(P<0.05)，而TSA能抑制KA诱导的改变。相对于0.03 mg/kg TSA干预组，0.1 mg/kg TSA干预组治疗作用更明显(P<0.05)。结论TSA能抑制癫痫后海马神经元凋亡、小胶质细胞活化及炎症因子的表达，同时能减轻惊厥发作的等级和延长惊厥的潜伏期，从而对癫痫后脑损伤起到保护作用。

TSA; 癫痫; 海马; 神经元; 小胶质细胞

癫痫是小儿时期常见的中枢神经系统疾病,以反复的惊厥发作为主要表现。发育期癫痫是婴幼儿常见的急危重症，发生率较成人明显增高，其发病率为3%～4%,其中部分为难治性癫痫或癫痫持续状态。癫痫能导致发育期不同程度脑损伤,包括运动发育落后,行为异常、学习和记忆能力下降，严重者可危及生命[1]。目前的抗癫痫药物的主要作用是控制症状，而不能影响癫痫发病机制或疾病的进展过程，并且有大约三分之一的患者用药治疗后不能有效控制癫痫发作[2]，因此开发新的抗癫痫药物是急需攻克的难题。曲古抑素A(trichostatin A,TSA) 是当下研究得很多的一类异羟肟酸组蛋白去乙酰化抑制剂(Histone acetylation inhibitor，HDACi)，它可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化水平，从而调控基因表达，诱导细胞分化及凋亡。在发育期小鼠癫痫模型中，研究表明HDACI干预治疗有很多积极的作用，包括减少神经元的凋亡和轴突的损伤，减轻炎症反应，同时HDACI有着明显的抗细胞兴奋毒性和抗氧化能力。体外实验证实了HDACI通过抗谷氨酸诱导的兴奋毒性和抗氧糖剥夺损伤从而保护神经元；同时还能延长皮层神经元的生命周期和促进神经细胞再生。HDACI能够通过增加组蛋白乙酰化水平上调神经元中的细胞保护蛋白 Bcl-2，对神经元前体细胞起到保护作用；同时，HDACI也能营养神经，促进神经细胞再生和突触可塑性的形成，从而提高神经细胞的存活率。目前关于TSA在神经系统疾病的研究主要集中在肿瘤的靶向治疗，脑出血与缺血性脑卒中，神经炎症及神经退行性疾病等[3-4],国内外尚未有TSA在发育期癫痫方面的报道。研究证实，神经元的凋亡、小胶质细胞的活化和炎症介质的产生参与了癫痫后脑损伤病理过程，并可影响癫痫的发生发展。本实验通过海人酸(kainic acid,KA)诱导发育期大鼠癫痫模型，观察TSA干预治疗对癫痫后大鼠海马组织神经元的凋亡、小胶质细胞的活化和炎症介质表达的影响，探讨TSA在癫痫后脑损伤发病中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及试剂20日龄健康雄性SD大鼠32只(南华大学实验动物中心提供)。KA，TSA(美国Sigma公司)，IL-1β、TNF-α抗体(Abcam公司)，CD68抗体(英国AbD Serotec公司)，ECL化学发光剂 (Santa Cruz公司),TUNEL凋亡试剂盒 (武汉博士德生物有限公司)，免疫组化二抗试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2大鼠癫痫模型的建立及分组32只雄性SD大鼠随机分为4组,对照组、KA组、小剂量TSA干预组(0.03 mg/kg)及大剂量TSA干预组(0.1 mg/kg)组,每组8只，通过腹腔注射KA制作发育期大鼠癫痫模型,出现Ⅳ～V级惊厥发作为造模成功(参考Racine分级标准)[5]，记录惊厥的发作等级及潜伏期；对照组仅注射生理盐水。TSA (0.03 mg/kg或0.1 mg/kg)在KA诱导癫痫前2 h腹腔注射给药。癫痫后24 h处死大鼠，留取海马组织标本,部分用4% 多聚甲醛固定,做病理切片及免疫组化染色,部分迅速保存于-80 ℃冰箱,用于Western blot实验。

1.3 HE染色观察脑组织病理学改变将组织切片在60 ℃恒温箱中烘烤30 min,然后置于松节油中浸泡30 min脱蜡,置于不同浓度梯度乙醇(从高到低)中脱去松节油，用蒸馏水洗5 min除去乙醇并水化。苏木精染色切片15 min,细胞核被染成紫蓝色，自来水冲洗2 min。将组织切片置于0.5%盐酸乙醇中30 s分化，自来水冲洗20 min。伊红染液染色30 s,细胞质染成粉红色，自来水冲洗30 s去浮色。切片经浓度梯度乙醇脱水(从低到高)，二甲苯浸泡透明，随后用中性树胶封片。在光学显微镜下观察HE染色下脑组织病理变化。

1.4 TUNEL染色检测神经元细胞凋亡海马组织经4% 多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片(厚度约3 μm)、脱蜡水化。标本片加0.01 mol/L TBS洗2 min×3次，按每张切片取TdT 和DIG-d-UTP各1 μL，加入18 μL标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液20 μL/片，然后置样品于湿盒中，37 ℃标记2 h。用0.01 mol/L TBS清洗后加封闭液50 μL/片，室温30 min，后加入生物素化抗地高辛抗体，置样品于湿盒中，37 ℃反应30 min。加入1∶100稀释的SABC，37 ℃反应30 min，随后DAB显色及苏木素复染。光镜下对每张切片随机选取面积相同的5个高倍视野(×400倍),肉眼计数每个高倍视野TUNEL染色阳性细胞数,即细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，然后取平均值。

1.5 CD68免疫组化染色检测活化的小胶质细胞

将海马组织病理切片先经过脱蜡、水化处理，然后浸泡到0.01 mmol/L 枸橼酸钠加热至沸腾进行抗原修复。先在切片上滴加3%H2O2以消除内源性过氧化物酶的活性；然后滴加一抗小鼠抗大鼠CD68(1∶100),4 ℃过夜；予PBS冲洗后在切片上滴加反应增强液，室温下孵育20 min；予PBS冲洗后再滴加兔抗小鼠二抗,室温下孵育30 min；予PBS冲洗后滴加新鲜配制的DAB试剂显色2～5 min。运用光学显微镜×400倍观察结果，海马CA1区随机选5个不同的视野,肉眼计数阳性细胞,取平均值即为活化的小胶质细胞数。

1.6 Western blot检测IL-1β和TNF-α蛋白表达量

取-80 ℃保存的海马组织,匀浆后加适量RIPA裂解液及PMSF蛋白酶抑制剂,离心,取上清,BCA 法测定蛋白浓度。每个标本取30 μg蛋白样本经10% SDS-PAGE 凝胶电泳，电泳后在低温下将目的蛋白用电湿转法转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶在37 ℃下封闭1 h,然后加IL-1β(1∶500)和TNF-α(1∶1 000)抗体,4 ℃孵育过夜。PBST清洗3次后用辣根过氧化物酶标记的兔二抗 (1∶5 000)在室温下孵育2 h,再次用PBST清洗3次后在膜上加入化学发光底物ECL显色1 min,用Image QuantTMLAS 4000成像系统扫描分析蛋白条带。

1.7统计学处理所有数据均采用SPSS20.0 统计学软件进行分析,数据均采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析,两两比较使用Bonferronit检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1平均惊厥等级和惊厥潜伏期评估本实验共选择20天SD大鼠40只,予KA造模时有5只大鼠因癫痫持续状态不能缓解死亡，死亡率为12.5%,最终纳入实验32只大鼠。实验中观察不同组惊厥发作级别及惊厥潜伏期见表1。惊厥等级评分大剂量TSA组显著低于KA组(P<0.05)；惊厥潜伏期大剂量TSA组显著长于KA组及小剂量TSA组(P<0.05)，而小剂量TSA组与KA组比较差异则无显著性(P>0.05)。本实验以0.1 mg/kg剂量为最佳。

表1大鼠惊厥发作等级和惊厥潜伏期评估

组别0级1级2级3级4级5级平均惊厥等级平均潜伏期(min)KA0000534.38±0.5263.88±13.78小剂量TSA组0122213.00±1.3171.88±14.36b大剂量TSA组1131202.25±1.39a109.8±17.25a

与KA组比较,a:P<0.05;与大剂量TSA组比较,b:P<0.05

2.2 HE染色观察脑组织病理学改变发育期大鼠癫痫后24 h，HE染色后光镜下观察海马组织病理学改变(图1)；正常对照组细胞染色均匀，呈淡蓝色,细胞壁完整，神经元结构清楚，未见水肿，变性及坏死(图1A)；KA组出现明显细胞水肿，神经元体积增大，核固缩深染，有核溶解、碎裂，细胞形态不完整，可见大量神经元凋亡及细胞碎片，伴有较多的炎症细胞浸润(图1B)；小剂量TSA干预组仍可见较多的神经元凋亡及细胞碎片，但细胞水肿及炎症细胞浸润较前有所减轻，细胞形态较前规则(图1C)；大剂量TSA干预组细胞水肿及炎症细胞浸润明显减轻，细胞体积及形态大部分正常，仅有少许的神经元凋亡及细胞碎片(图1D)。

2.3 TSA抑制KA诱导的海马神经元凋亡

TUNEL染色测定发育期大鼠癫痫后24 h海马组织神经元凋亡的数量(图2)，TUNEL染色阳性可见细胞核中有棕色或棕黄色着染,伴有染色质浓缩、边缘化及核膜裂解等现象;正常细胞核染色呈蓝色。

图1 HE染色观察癫痫后24 h海马CA1区脑组织病理学改变 A：对照组；B：KA组；C：小剂量TSA干预组；D：大剂量TSA干预组

大鼠海马组织中的神经元凋亡数：对照组2.2±0.83个/mm2，KA组81.4±4.5个/mm2，小剂量TSA组43.6±3.2个/mm2，大剂量TSA组21.0±3.2个/mm2。KA组(图2B)在海马CA1区有大量的TUNEL染色阳性细胞，与对照组(图2A)相比神经元凋亡数量显著增加(P<0.05)；TSA干预组能显著抑制PTZ诱导的海马神经元凋亡(图2C、图2D，P<0.05)，其中以大剂量TSA组的抑制更明显(P<0.05)。

图2 TUNEL染色观察癫痫后24 h海马CA1区凋亡的神经元数目 A：对照组；B：KA组；C：小剂量TSA干预组；D：大剂量TSA干预组；E：TUNEL阳性细胞计数。与对照组比较,*:P<0.05；与KA组比较，△:P<0.05;与小剂量TSA组比较，#:P<0.05

2.4 TSA抑制癫痫后小胶质细胞活化CD68染色测定发育期大鼠癫痫后24 h海马组织活化的小胶质细胞数量(图3)，活化的小胶质细胞可被染成褐色或棕褐色。正常情况下小胶质细胞处于静止状态，胞体较小,有着长的，细的放射状分支；活化的小胶质细胞体积变大，呈圆形或阿米巴状，细胞突起变短或消失。大鼠海马CA1区活化的小胶质细胞数：对照组2.4±1.52个/mm2，KA组77.9±9.87个/mm2，小剂量TSA组65.4±7.80个/mm2，大剂量TSA组21.4±3.51个/mm2。与对照组(图3A)相比，KA组(图3B)在活化的小胶质细胞数量显著增加(P<0.05)，细胞体积变大，细胞突起变短或消失；大剂量TSA组(图3D)能显著抑制小胶质细胞的活化(P<0.05)，可见大部分细胞体积正常，胞体可见放射状分支。

2.5 TSA减少IL-1β和TNF-α蛋白表达水平Western blot结果显示各组蛋白光密度与内参β-actin比值如下(图4)：对照组：IL-1β为0.37±0.05，TNF-α为0.32±0.05；KA组：IL-1β为1.01±0.10，TNF-α为0.95±0.11；小剂量TSA组：IL-1β为0.89±0.08，TNF-α为0.70±0.11；大剂量TSA组：IL-1β为0.43±0.09，TNF-α为0.45±0.05。KA组IL-1β和TNF-α蛋白水平较对照组显著增高(P<0.05)，予大剂量TSA干预治疗对IL-1β和TNF-α增高均有显著的抑制作用(P<0.05)；予小剂量TSA干预治疗仅对IL-1β增高有显著的抑制作用(P<0.05)；大剂量TSA治疗效果明显优于小剂量TSA(P<0.05)。

图3 CD68染色观察癫痫后24 h海马CA1区活化的小胶质细胞数 A：对照组；B：KA组；C：小剂量TSA干预组；D：大剂量TSA干预组；E：活化的小胶质细胞计数。与对照组比较，*:P<0.05；与KA组比较，△:P<0.05;与小剂量TSA组比较，#:P<0.05

图4 Western bolt检测癫痫后24 h海马区IL-1β和TNF-α蛋白表达水平 A:Western blot蛋白条带；B：柱状图表示各组蛋白光密度与内参β-actin比值即相对蛋白表达水平.与对照组比较，*:P<0.05；与KA组比较，△:P<0.05;与小剂量TSA干预组比较，#:P<0.05

3 讨 论

癫痫是由于大脑神经元的异常放电引起的反复惊厥,由于中枢神经系统内在的复杂性，关于癫痫后脑损伤的发病机制研究还很局限。目前公认的癫痫的基本病理过程包括急性炎症反应,神经元细胞凋亡，小胶质细胞活化，氧化应激,钙超载和线粒体功能障碍[6-7]。因而减少炎症反应，抑制小胶质细胞活化和神经元细胞的凋亡可能是一个重要的抗癫痫途径。在本实验中，选择海人酸KA诱导发育期大鼠癫痫模型，因为这个模型造成的癫痫活动和脑损伤类似于人类颞叶癫痫模型，与临床研究更有相关性[8]，同时KA制作癫痫模型在国内外已经很成熟，注射剂量和方式容易把握，重复性好。TSA是HDACI的一种，与传统的抗癫痫药VPA有着许多类似的作用，如能减少脑梗死和脑出血的面积，降低LPS诱导的多巴胺能神经兴奋毒性，改善内毒素诱导的神经炎症等[9]，故本实验选择了TSA干预治疗，以进一步探讨癫痫后脑损伤的发病机制和可能的治疗途径。

神经元凋亡是癫痫后细胞死亡的重要形式，与癫痫后大量氧自由基生成及凋亡相关蛋白酶激活有关[10]。本实验TUNEL染色和HE染色显示，发育期大鼠癫痫后24 h海马CA1区神经元凋亡数量较对照组显著增加，伴有细胞体积增大，水肿，说明神经元凋亡参与了癫痫的病理过程。TSA治疗后神经元的凋亡数量减少，细胞水肿减轻，同时可以减少惊厥持续时间和延长惊厥的潜伏期，说明TSA对癫痫后脑损伤有保护作用。TSA对神经细胞保护的机制可能是通过直接抑制氧化调控相关蛋白Prx I以及Prx II的去乙酰化修饰,从而参与细胞内氧化应激的调控，减少神经元的凋亡[11]；在研究氧化应激保护作用的机制中发现，TSA在H2O2诱导氧化损伤后能够诱导一些抗氧化蛋白的表达如过氧化氢酶(Catalase)、超氧化歧化酶(SOD)、过氧化酶(Prx)等，它们可将体内过剩的氧自由基快速及时的清除，增加细胞的抗氧化水平,从而使细胞免于死亡[12]；同时TSA可通过直接阻止剪接型X盒结合蛋白1(X-boxbinding protein 1 spliced，XBP1S)的去乙酰化,增加其蛋白稳定性,从而上调多个对抗氧化应激相关基因表达,进而对抗氧化应激所致的神经元凋亡[13]。也有研究指出TSA可以抑制神经元的存活，同时增加多巴胺能神经元对神经毒素的易受损性，因而在使用TSA治疗脑损伤时应保持谨慎[14]。

小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的巨噬细胞,在大脑的免疫炎症反应中有着重要的作用，广泛参与了CNS的损伤过程。活化的小胶质细胞可分泌、释放细胞毒性因子和促炎因子,抑制神经元的呼吸链,使神经元中ATP急剧减少最终因能量衰竭而死亡,这种损伤可能导致癫痫的发作,并影响癫痫发作的潜伏期和持续时间[15]。同时，活化的小胶质细胞可能会通过减少神经营养因子的生成或分泌促炎因子来抑制轴突的再生和加剧神经元的死亡[16]。本实验CD68染色显示，发育期大鼠癫痫后24 h海马CA1区活化的小胶质细胞数量较对照组显著增加，说明小胶质细胞活化参与了癫痫的病理过程。使用TSA治疗后能明显抑制小胶质细胞所致的炎症反应,减少活化的小胶质细胞，并且能调控小胶质细胞由吞噬型向静止型转变，说明TSA能通过减少小胶质细胞活化所导致的炎症反应，从而对癫痫后脑损伤起到保护作用；也有报道指出TSA能诱导小胶质细胞等神经免疫细胞的凋亡从而减少炎症介质的合成[9]。

白细胞介素IL-1β是由多种细胞产生并可作用于多种细胞的一类细胞因子。IL-1β在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。肿瘤坏死因子TNF-α是由巨噬细胞对感染或其他免疫源反应自然产生的细胞因子，它能促进细胞增殖和分化，是重要的炎症因子，并参与某些自身免疫病的病理损伤。大量研究发现各种途径诱发的癫痫模型大鼠脑组织IL-1β和TNF-α的表达增加，且均与癫痫后脑损伤的发生有关[17]。在本实验中Western blot测定了癫痫后IL-1β和TNF-α蛋白的含量，发现癫痫后KA组各指标的含量较对照组显著增加，证实了炎症介质参与了癫痫后脑损伤的病理过程。TSA干预治疗后减少了炎症介质的产生，从而发挥了脑保护作用，其可能的机制如下：① TSA可能通过抑制IRAK-1/NF-κB/p38/JNK和TLR4/MYD88信号通路,从而减少IL-1β、TNF-a的合成[18]。②TSA通过诱导高乙酰化，增加了抗炎症因IL-10、TGF-β基因和蛋白表达。③在巨噬细胞或单核细胞中,TSA可增加HSP90组蛋白乙酰化水平,导致其与白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK1)失联,使IRAKI降解，从而间接抑制IL-1β[19]。也有报道指出，TSA可以促进炎症介质如IL-1β、TNF-a的生成，这种促进作用完全不依赖于传统的炎症通路的激活，而主要是通过caspase-8依赖的信号转导机制从而促进IL-1β等炎症介质的合成[20]。

总之，本实验结果可以证实TSA能抑制癫痫后海马神经元凋亡、小胶质细胞活化及炎症因子的表达，同时能减轻惊厥发作的等级和延长惊厥的潜伏期，表明TSA 有潜在的神经保护作用和抗癫痫作用，为临床治疗癫痫提供了一个新的途径和思路。

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TheProtectionEffectsandMechanismsofTSAonSeizures-InducedBrainDamageinDevelopingRat

HUANG Xiangyi，HU Qingpeng,FENG Wei,et al

(TheSecondAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveThis study aimed to investigate the protection effects and mechanisms of Histone deacetylase inhibitor (HDACi) TSA on seizure-induced brain damage of developing rats.Methods32 male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 4 groups:Control group,KA group,0.03 mg/kg TSA treated group and 0.1 mg/kg TSA treated group.Intraperitoneal administration of KA induced rat seizures.TSA was injected intraperitoneally 2 hours before KA injection.The seizure stage and seizure latency were recorded after KA injection.Hippocampus tissues were sampled at 24 hours after seizures.Brain tissue pathological changes were observed by HE staining;Apoptotic neuron were observed using TUNEL immunohistochemical staining;Activated microglia were detected by CD68 mmunohistochemical staining;IL-1β and TNF-α protein were detected using Western Blot.ResultsThe brain tissue pathological changes,apoptosis of neurons,activated microglia,IL-1β and TNF-α protein and seizure latency significantly increased after KA treatment (P<0.05),but these effects were attenuated by adding TSA.Compared with 0.03 mg/kg TSA treated group,0.1 mg/kg TSA treated group plays a more important role in protecting against seizure-induced brain damage.ConclusionsHistone deacetylase inhibitor TSA can reduce brain tissue pathological changes,apoptosis of neurons,activated microglia and inflammation factor.This suggests a protective effect against brain damage associated with seizures in developing rats.

TSA; seizures; hippocampus; neuron; microglia

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.06.008

2016-04-27；

2016-07-08

*通讯作者，E-mail:yanguowuhen0011@sina.com.

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蒋湘莲)