紫檀茋诱导白念珠菌凋亡的研究

胡丹丹 毕爽 姜远英 王彦

(中国人民解放军第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433)



·论著·

紫檀茋诱导白念珠菌凋亡的研究

胡丹丹 毕爽 姜远英 王彦

(中国人民解放军第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433)

目的 探究紫檀茋 (Pterostilbene，PTE)诱导白念珠菌凋亡的活性。方法 通过分析白念珠菌凋亡细胞、坏死细胞和活细胞比例，检测Caspase酶活性、细胞内活性氧和线粒体膜电位，评价PTE诱导白念珠菌凋亡的活性。结果 ≥4 μg/mL PTE处理后白念珠菌凋亡比例明显增加，Caspase酶活性显著升高，细胞内活性氧水平显著升高，线粒体膜电位显著降低。结论 PTE具有诱导白念珠菌凋亡的活性，该作用可能与活性氧积累和线粒体损伤相关。

白念珠菌；紫檀茋；细胞凋亡

[Chin J Mycol，2016，11(2):75-78]

白念珠菌是临床常见的条件致病真菌，能引起人类浅表和系统性感染，免疫功能低下人群更为易感，已成为重症监护患者死亡的最重要的直接原因之一，同时也是引发血管导管相关感染的第四大原因和导尿管相关感染的第三大原因[1-3]。临床可用的抗真菌药物品种非常有限，而且白念珠菌耐药的问题日益凸显，研发新机制的抗真菌药物迫在眉睫。紫檀茋 (Pterostilbene，PTE)是一种存在于多种天然植物中的茋衍生植物抗毒素，有研究报道其能够通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用[4]。此外，我们前期研究发现，PTE具有抑制白念珠菌生物被膜的作用。在本研究中我们观察了PTE对白念珠菌凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌标准菌株SC5314由美国华盛顿乔治敦大学William A.Fonzi教授馈赠。

药物 PTE由中科院广州化学研究所合成。黄芩素 (Baicalein，BE)和法尼醇 (Farnesol)均从Sigma-Aldrich公司购买。

试剂 Annexin-V-FITC Apoptosis Detection Kit，购于凯基生物科技。CaspSCREENTMFLow Cytometric Apoptosis Detection Kit，购于BioVision。DCFH-DA试剂盒，购于碧云天。JC-1荧光染料，购于Molecular Probes®。磷酸盐缓冲溶液 (Phosphate Buffered Saline，PBS)(0.8%NaCl，0.04%KCl，0.0133%Na2HPO4，0.006%KH2PO4，0.035%NaHCO3)。

培养基 YPD液体培养基 (1%酵母提取物，2%蛋白胨及2%葡萄糖)。SDA固体培养基 (1%蛋白胨、4%葡萄糖及2%琼脂)。

实验仪器 HZQ-F160全温振荡培养箱，江苏省太仓市实验设备厂。FACSCalibur流式细胞仪，美国。TECAN Infinite M200多功能酶标仪，瑞士。

1.2 方法

菌株培养 从4℃保存的SDA固体培养基上挑取白念珠菌SC5314单克隆中于YPD液体培养基，在30℃、200 r/min振荡培养，活化16 h后用于实验。

PTE处理后凋亡细胞、坏死细胞和活细胞比例分析[5]实验选择BE和Farnesol作为诱导细胞凋亡的阳性药物与PTE进行比较，使用Annexin-V-FITC Apoptosis Detection Kit检测。白念珠菌于YPD液体培养基中培养至指数生长期 (OD600=0.5)，分别用不同剂量的PTE、BE和Farnesol处理3 h。处理后，将菌细胞 (1×105)用500 μL Binding Buffer重悬，并顺序加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide (PI)。充分混合，25℃下避光孵育15 min，然后通过流式细胞仪检测分析，激发波长488 nm，发射波长530 nm。

Caspase酶活性检测[6]使用CaspSCREENTM Flow Cytometric Apoptosis Detection Kit检测Caspase酶活性。白念珠菌培养同上，调节细胞浓度为1×106CFU/mL，然后用不同剂量的PTE、BE和Farnesol处理3 h。药物处理后，将细胞用PBS洗涤3次。用0.3 mL的Incubation Buffer重悬细胞至1×105CFU/mL，水浴加热至37℃，然后加入3 μL浓度为1 mol/L的DTT (使终浓度为10 mmol/L)和1 μL的D2R reagent。37℃下避光孵育10～20 min。然后使用流式细胞仪检测荧光信号，激发波长488 nm，发射波长530 nm。

细胞内活性氧 (ROS)含量检测[7]使用DCFH-DA试剂盒对细胞内ROS含量进行测定。白念珠菌培养同上，调节细胞浓度至1×106CFU/mL，然后用不同剂量的PTE、BE和Farnesol处理3 h。药物处理后，将细胞用PBS洗涤3次，并重悬至1×107CFU/mL。加入DCFH-DA使其终浓度为10 μmol/L，37℃下孵育20 min，离心取100 μL上清液至平底微孔板 (96孔，透明)。使用多功能酶标仪检测荧光强度，激发波长485 nm，发射波长520 nm。

线粒体膜电位检测[5,7]白念珠菌培养至指数生长期 (OD600=0.5)，然后用不同剂量的PTE、BE和Farnesol处理3 h。药物处理后，将细胞用PBS洗涤3次，并重悬至1×106CFU/mL。用10 μg/mL的JC-1染料处理，37℃下避光孵育20 min后，将细胞用PBS洗涤2次，并浓缩为100 μL转移至黑色96孔微孔板。使用多功能酶标仪检测荧光强度，激发波长为488 nm，发射波长从绿色 (～525 nm)至红色 (～590 nm)。线粒体膜电位由红色与绿色荧光的比值来确定。

1.3 统计分析

采用GraphPad Prism 5对全部数据进行分析，采用t检验方法比较两组间均数，P<0.05认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 PTE诱导白念珠菌细胞发生凋亡

空白组正常凋亡细胞约占3%，用PTE处理白念珠菌3 h，4 μg/mL的PTE即可诱导14%的白念珠菌发生凋亡，当剂量增至8 μg/mL或16 μg/mL时，凋亡细胞比例约17%。实验过程中我们将已报道有诱导白念珠菌凋亡活性的黄芩素 (BE)和法尼醇 (Farnesol)作为阳性对照药物[8-9]，4 μg/mL的BE和Farnesol诱导白念珠菌细胞凋亡的比例分别为18%和20% (见图1)。

2.2 PTE处理后白念珠菌Caspase酶活性升高

Caspase是真核细胞凋亡过程中一类重要的酶[10]，其活性可作为检测细胞凋亡的指标，通过检测荧光信号确定细胞D2R染色率，可反映出细胞内Caspase酶活性。白念珠菌经PTE处理3 h后，2 μg/mL处理组细胞染色率为12.10%，与对照组没有显著差异。4 μg/mL、8 μg/mL和16 μg/mL处理组细胞染色率分别为69.70%、72.34%和74.70%，与0 μg/mL的空白对照组相比，细胞Caspase酶活性皆显著升高 (P<0.001)。作为阳性对照的4 μg/mL BE处理组和Farnesol处理组，细胞染色率分别为76.07%和74.55% (P<0.001)(见图2)。

2.3 PTE处理后白念珠菌细胞内ROS积累

细胞凋亡可能触发线粒体膜超极化，细胞内ROS增加[11]，因此我们利用荧光试剂DCFH-DA检测了PTE处理后白念珠菌细胞内ROS含量的变化。与0 μg/mL的空白对照组相比，4 μg/mL PTE处理组细胞内ROS的水平显著增加 (P<0.01)，约为空白对照组的2倍。8 μg/mL和16 μg/mL PTE处理组ROS水平升高更为明显 (见图3)。

2.4 PTE处理后白念珠菌线粒体膜电位降低

线粒体膜通透性增加被普遍认为是细胞凋亡的标志之一[11]。我们应用荧光试剂JC-1检测了线粒体膜电位。PTE处理3 h后，2 μg/mL处理组与对照组相比线粒体膜电位没有明显变化。4 μg/mL及更高浓度的PTE处理组膜电位显著降低至约0 μg/mL空白对照组的一半 (P<0.05)，与BE和Farnesol阳性对照药组相近 (见图4)。

图1 PTE处理3 h后白念珠菌凋亡、坏死和活细胞比例 图2 PTE处理3 h后对白念珠菌Caspase酶活性的影响 (与对照组相比，***P<0.001) 图3 PTE处理3 h后对白念珠菌细胞内ROS水平的影响 (与对照组相比，**P<0.01) 图4 PTE处理3 h后对白念珠菌线粒体膜电位的影响 (与对照组相比，*P<0.05)

Fig.1 The percentages ofC.albicanscells that are apoptotic (black bars) and necrotic (white bars) after exposure to different concentrations of PTE for 3 h Fig.2 The Caspase activity ofC.albicansafter exposure to different concentrations of PTE for 3 h Fig.3 ROS levels inC.albicansafter exposure to different concentrations of PTE for 3 h.The ROS level was presented by fluorescence intensity Fig.4 Mitochondrial membrane potential ofC.albicansafter exposure to different concentrations of PTE for 3 h.Mitochondrial membrane potential assay was determined by the ratio of red to green fluorescence intensity

3 讨 论

细胞凋亡是细胞自主有序的死亡，是生物体普遍存在的过程[12]。诱导或促进细胞凋亡目前已成为抗肿瘤的治疗策略[5]，对我们抗真菌方面的研究有一定的借鉴意义，诱导病原真菌的凋亡可能成为抗真菌的新策略。

PTE是一种茋类化合物，提取自小浆果如蓝莓、葡萄等，具有抗炎、抗氧化、降血糖和降血脂等多种生物学活性[6]，可以作为保健品使用[7]。此外，研究发现PTE具有抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡的作用[13-14]，且实验证明，PTE不影响大鼠L6成肌细胞和大鼠皮肤成纤维细胞的增殖[13]。可见，PTE作为药物安全性很高。

我们前期报道了PTE抑制白念珠菌生物被膜的活性[15]，在本研究中我们发现，PTE可以诱导白念珠菌发生细胞凋亡。本研究中选取BE和Farnesol作为阳性对照药物，前期报道证实，二者在4 μg/mL时均具有诱导白念珠菌凋亡的作用[8-9]。

为深入研究PTE诱导白念珠菌凋亡的作用，我们测试了一系列细胞凋亡相关的指标。我们首先分析了凋亡细胞、坏死细胞和活细胞的比例，这是检测细胞凋亡最直接的方法。结果揭示了PTE诱导白念珠菌细胞凋亡的活性。之后，我们检验了Caspase酶活性和线粒体功能相关指标。Caspase是一类半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，该酶被激活后通过切割蛋白来传递蛋白水解级联信号，引发细胞凋亡过程[10,16-17]。本研究中使用的D2R通过被Caspase分解释放出绿色荧光物质，因此被用于考察Caspase酶的活性。研究结果显示，PTE诱导的白念珠菌细胞凋亡过程确与Caspase依赖性通路相关。前人在模式生物酿酒酵母中的研究表明线粒体介导细胞凋亡的Caspase通路，当凋亡信号分子作用于线粒体时，线粒体通透性改变，膜电位降低，线粒体解偶联，产生大量ROS，随之细胞凋亡过程启动[18-20]。在本研究中，PTE在4 μg/mL时诱导凋亡作用明显，与4 μg/mL BE和Farnesol相当，但当PTE浓度进一步升高时，诱导凋亡作用并未显著增强。PTE处理后白念珠菌线粒体膜电位降低，细胞内ROS水平升高，该结果提示，PTE诱导白念珠菌凋亡的过程同样与线粒体损伤相关。

综上所述，本研究首次报道了PTE能够诱导白念珠菌凋亡，该过程与线粒体损伤相关。通过药物诱导白念珠菌凋亡可能为抗真菌药物研发提供新思路。PTE生物安全性高，应用前景广泛，PTE能够诱导白念珠菌凋亡的发现对新型抗真菌药物研发具有重要指导意义。

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[本文编辑] 施 慧

Pterostilbene induces apoptosis inCandidaalbicans

HU Dan-dan,BI Shuang,JIANG Yuan-ying,WANG Yan

(NewDrugResearchandDevelopmentCenter,SchoolofPharmacy,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Objective To explore the activity of Pterostilbene (PTE) in inducing apoptosis ofCandidaalbicans.Methods We used apoptosis,necrosis and overall viability assays,caspase activity determination,ROS measurement and mitochondrial membrane potential assay to evaluate the activity of PTE in inducing apoptosis ofC.albicans.Results AfterC.albicanstreated with ≥4 μg/ml PTE,the percentage of apoptosis cells and activity of Caspase notably increased.Moreover,the mitochondrial membrane potential decreased significantly and the intracellular ROS increased.Conclusions PTE has an apoptosis-inducing effect onC.albicans,and this effect may be associated with ROS accumulation and mitochondrial injure.

Candidaalbicans;pterostilbene;apoptosis

国家自然科学基金 (81273558,81072678)；上海市浦江人才计划 (14PJD001)

胡丹丹，女 (汉族)，博士研究生在读.E-mail:dandanhu1989@163.com；毕爽，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:shuangxun640@126.com

王彦,E-mail:wangyansmmu@126.com;姜远英，E-mail:jiangyuanying@126.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0075-04

2015-10-08