非小细胞肺癌细胞A549对紫杉醇耐药机理研究

郭莲娣，王 丹，李佳川，王 鑫，王小军

(1.西南民族大学药学院，四川 成都 610041；2.四川大学华西第二医院，四川 成都 610041)

非小细胞肺癌细胞A549对紫杉醇耐药机理研究

郭莲娣1，王 丹1，李佳川1，王 鑫2，王小军2

(1.西南民族大学药学院，四川 成都 610041；2.四川大学华西第二医院，四川 成都 610041)

目的利用非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的耐药株A549/taxol，研究其对紫杉醇耐药性的分子机理.方法通过长时间低浓度的紫杉醇处理A549细胞的方法获得其耐药细胞株A549/taxol，提取细胞总RNA并逆转录为cDNA，实时荧光定量PCR观察其凋亡基因的表达情况，并通过不同siRNA处理细胞进行基因沉默，研究其在不同遗传背景下对紫杉醇的耐受情况.结果发现非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的耐药株A549/taxol的基因表达紊乱，表现为ING5的高表达抑制了凋亡基因Bcl-2的表达水平，而Bcl-2是紫杉醇诱导细胞凋亡所必需的.结论以上结果初探了A549对紫杉醇耐药性的机制，为探寻紫杉醇化疗新策略提供了新的思路.

非小细胞肺癌；紫杉醇；Bcl-2；ING5

紫杉醇是一类二萜类生物碱，是目前最有效的植物抗癌药之一，最早是由Wani等在1971年从主要分布在美国北部的短叶红豆杉的树皮中分离出来并命名的[1].紫杉醇(taxol)是一种广谱的抗癌化疗药物，对某些晚期的恶性肿瘤如肺鳞癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌等有较好的疗效，因此广泛地用于抗肿瘤的临床治疗[2].紫杉醇结合在微管蛋白的N端，抑制其解聚，从而破坏微管和微管蛋白二聚体之间的动力学平衡，阻滞细胞周期于G2/M期，抑制有丝分裂最终导致细胞凋亡[3].由于独特的抗肿瘤机制，紫杉醇成为近年最常用的化疗药物之一，但仍然有许多恶性肿瘤对其存在耐药性.该耐药性的机制尚不明确，但主要表现在两个方面.一是微管蛋白的突变，Monzo M等从43例接收紫杉醇化疗的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的组织中提取DNA，发现其中33%的患者中β-微丝蛋白基因存在突变，且其化疗有效率为0[4].另一个方面是其他基因特别是凋亡通路基因表达的改变，紫杉醇诱导细胞凋亡依赖于Raf-1/Bcl-2、P28、caspases-3等重要凋亡基因，如果这些基因或通路缺陷，将大大降低紫杉醇的化疗效果[5，6].由此可见，寻找新的化疗策略是紫杉醇临床治疗中一个亟待解决的问题.

ING5(Inhibitor of growth protein 5)是ING家族中一个重要的抑癌基因，在DNA损伤修复，染色质重塑和细胞凋亡等生理过程中起重要作用[7].ING5的NCR结构域能与组蛋白乙酰转移酶结合从而调节基因的表达，同时，它能与P53和EP300结合参与细胞凋亡通路[8-10].本研究通过深入探讨非小细胞肺癌细胞系A549对紫杉醇的耐药分子机制，发现ING5导致的Bcl-2表达降低是造成A549对紫杉醇耐药的关键因素，同时沉默ING5联用紫杉醇对非小细胞肺癌细胞的化疗增敏，为探寻紫杉醇化疗新策略奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 材料

非小细胞肺癌细胞系A549由四川大学华西第二医院基因组稳定性实验室提供；胎牛血清及DMEM培养基购自Gibco；转染试剂Turbo infection购自Thermo；紫杉醇购自sigma；RNA提取试剂盒购自O-mega；逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自Promega；siRNA购自上海吉凯基因生物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 耐药细胞株的构建

在正常传代的A549细胞株中始终加入低浓度的紫杉醇(0.1μM)筛选细胞，一个月后将单个细胞铺在96孔板中，加入较高浓度的紫杉醇(5μM)筛选.将能形成克隆的细胞用不含紫杉醇的培养基培养后鉴定其对不同浓度紫杉醇的敏感性，筛选出具有紫杉醇耐药性的细胞克隆.

1.2.2 细胞克隆形成实验

取生长旺盛的细胞，0.25%胰蛋白酶消化后吹打成单个细胞，用血球计数板计数并梯度稀释至每个10cm培养皿中接种100，200，500个单个细胞，加入10 ml培养基置于37℃培养箱中培养一周左右.当在显微镜下能观察到明显的细胞克隆形成时，弃掉培养基，用PBS小心地洗两次，加入醋酸/甲醇(1:3)固定5 min.弃掉固定液，在吉姆萨染色液染色20 min后洗掉染液，吹干后与菌落计数板上计数，计算出存活率.

1.2.3 基因的表达

用0.25%胰蛋白酶消化细胞，离心并用PBS洗两次，利用Omega RNA提取试剂盒抽提细胞总RNA.测定浓度后取1μg进行反转录，一步法37℃孵育1h获得cDNA，采用Promega qPCR试剂盒及Bio-Rad CFX96荧光定量系统进行荧光定量PCR分析.

2 结果

2.1 Bcl2及ING5在A549紫杉醇耐药细胞中表达异常

通过长期低浓度的紫杉醇处理获得了非小细胞肺癌细胞系A549耐紫杉醇细胞系A549/taxol，其对紫杉醇的敏感度大幅度降低，存活率升高(图1，a).为了探寻A549/taxol细胞系对紫杉醇耐药的分子机理，我们筛选了大量细胞周期及凋亡通路蛋白质的转录及表达情况，发现抑癌基因ING5的表达异常升高，而凋亡通路信号蛋白Bcl-2的表达大幅度降低，其他的基因几乎不受影响(图1，b)，提示A549/taxol的耐药性可能是Bcl-2及ING5异常表达引起的.

2.2 平衡Bcl-2及ING5的表达水平能逆转A549/ taxol对紫杉醇的耐药

为了证实Bcl-2及ING5对A549/taxol耐药性的影响，利用基因沉默ING5及过表达Bcl-2的方法重新平衡A549/taxol细胞中基因表达的水平，发现能逆转其对紫杉醇的抗性，表明其耐药性来自于Bcl-2及ING5基因表达的紊乱(图2，a).有意思的是，在A549细胞中沉默ING5后Bcl-2的表达水平明显增高，反之过表达ING5导致Bcl-2的表达大幅度降低，证明Bcl-2的基因表达受到ING5的负相关调控(图2，b).

图1 A549/taxol耐药细胞系中基因表达Fig.1 Analysis of the gene expression of cell line A549/taxol

图2 ING5的表达水平对A549/taxol细胞的耐药性及Bcl-2表达的影响Fig.2 Effect of different expression level of ING5 on taxol resistance and expression of Bcl-2 in A549/taxol cell.

2.3 Bcl-2是A549/taxol细胞系耐药的效应蛋白

在A549/taxol细胞系中沉默Bcl-2并不能改变其对紫杉醇的敏感性，表明Bcl-2是紫杉醇诱导A549细胞凋亡所必需的.重要的是，同时沉默ING5及 Bcl-2并不能逆转A549/taxol细胞系对紫杉醇的耐药性，表明其耐药的效应蛋白是Bcl-2.由于ING5的高表达导致Bcl-2的水平降低，从而抑制了由Bcl-2介导凋亡通路，产生对紫杉醇的耐受(图3).

图3 不同的ING5及Bcl-2表达水平对A549/taxol细胞耐药性的影响(∗P＜0.05；∗∗P＜0.01)Fig.3 Effect of different expression level of ING5 and Bcl-2 on taxol resistance of A549/taxol cell(∗P＜0.05；∗∗P＜0.01)

3 讨论

恶性肿瘤对化疗药物的耐药性一致是肿瘤临床治疗的难点，紫杉醇作为最常用的广谱化疗药物，主要通过破坏微管的动力学平衡后诱导细胞凋亡通路的激活而抑制肿瘤.这个过程依赖于Bcl-2蛋白的磷酸化[11-12]，在Bcl-2缺陷的细胞系中，紫杉醇往往不能诱导其凋亡，表现为对紫杉醇的耐药性.Bcl-2需要与BAX结合形成异源二聚体从而诱导细胞的凋亡[13-15]，然而在紫杉醇耐药细胞株A549/taxol中并未发现BAX的表达异常，这与Bcl-2是其耐药性的效应蛋白是一致的.ING5在耐药细胞株中高度表达抑制了Bcl-2的基因表达，这是A549/taxol产生耐药性的重要原因，然而ING5负相关调控Bcl-2基因表达的分子机制尚不清楚，需要进一步的研究.

我国是肿瘤大国，紫杉醇在肿瘤治疗的化疗过程中被广泛使用，但紫杉醇耐药性一直是困扰临床治疗多年的一个重要问题，发现其耐药机理，开发新的化疗策略是其化疗过程中一个急需解决的关键技术.本文通过构建非小细胞肺癌紫杉醇耐药细胞株A549/ taxol，发现其相关凋亡基因ING5及Bcl-2的表达异常，证实了其耐药性的分子机理是由于ING5负调控Bcl-2导致的相关细胞凋亡通路缺陷造成的，为探寻紫杉醇化疗新策略奠定了重要的理论基础，提供了新的思路.

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(责任编辑:李建忠，付强，张阳，罗敏；英文编辑:周序林，郑玉才)

GUO Lian-di1，WANG Dan1，LI Jia-chuan1，WANG Xin2，WANG Xiao-jun2
(1.School of Pharmacy，Southwest University of Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.；2.West China Second University Hospital of Sichuan University，Chengdu 610041，P.R.C.)

Objective To study the mechanism of taxol resistance of A549，the taxol resistant cell line A549/taxol was used.Methods The taxol resistant cell line A549/taxol was constructed by low concentration and long time treatment of taxol.The apoptosis gene expressions were detected by qPCR of cDNA reverse transcripted from the total cell RNA，to study the tolerance ability anti-taxol of A549 in different genetic backgrounds through gene silence by siRNA.Results It was found that the taxol resistant cell line A549/taxol was successfully constructed and the gene expression was disordered.High expressed ING5suppressed the mRNA level of Bcl-2，which is necessary of cell apoptosis.Conclusion A novel mechanism of taxol resistance of A549 was found，which provides a new way to explore the strategy of chemotherapy using taxol.

nonsmall-cell lung cancer；taxol；Bcl-2；ING5

R285

A

2095-4271(2016)05-0511-05

10.11920/xnmdzk.2016.05.008

Taxol resistance mechanism of NSCLC cell line A549

2016-07-22

郭莲娣(1974—)，女，汉族，河南信阳人，讲师，博士，研究方向:中药抗DNA损伤作用的研究.E-mail:1031572133＠qq.com

国家自然科学基金面上项目(30970950)；中央高校基本科研业务费专项基金项目(2015NZYQN63)；国家级大学生创新创业训练计划项目(201610656073)