桔皮素对人肝癌HepG2细胞体外增殖和侵袭的影响及机制研究

孙志欣，张 莹（天津中医药大学第一附属医院急症病房，天津 300193）

桔皮素对人肝癌HepG2细胞体外增殖和侵袭的影响及机制研究

孙志欣＊，张 莹（天津中医药大学第一附属医院急症病房，天津 300193）

目的：考察桔皮素对人肝癌HepG2细胞体外增殖和侵袭的影响，并探讨其作用机制。方法：以0（空白对照组）、10、20、40、60、80µmol/L桔皮素分别作用于细胞24、48 h后，采用CCK-8法检测细胞增殖率，并计算其半数抑制浓度（IC50）。以0、20、30 μmol/L桔皮素作用细胞48 h后，采用Transwell侵袭实验考察其对细胞侵袭的影响；并分别采用实时荧光定量聚合酶链式反应法和Western blot法考察其对细胞中E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Notch-1、免疫细胞表面抗原44（CD44）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）mRNA及其蛋白表达的影响；采用Western blot法考察蛋白激酶B（Akt）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的磷酸化水平。结果：10～80µmol/L桔皮素对人肝癌HepG2细胞的体外增殖均具有明显的抑制作用，且呈时间和剂量依赖性，增殖率较空白对照组显著降低（P＜0.05），作用24、48 h后的IC50分别为55.7、23.4 μmol/L。20、30 μmol/L桔皮素作用48 h后，细胞侵袭能力明显受到抑制；细胞中N-cadherin、Vimentin、Notch-1、CD44和MMP-9 mRNA及其蛋白水平表达明显降低，E-cadherin mRNA及其蛋白表达水平明显升高，且Akt、GSK-3β磷酸化水平升高，较空白对照组差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：桔皮素可抑制人肝癌HepG2细胞的体外增殖和侵袭；其机制可能与下调细胞中Notch-1表达、抑制细胞的上皮-间质转化而抑制CD44和MMP-9的表达，以及抑制其上游Akt-GSK-3β信号途径有关。

桔皮素；人肝癌HepG2细胞；增殖；侵袭；上皮-间质转化

肝癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一，且近年其发病率和病死率均有上升的趋势[1]。即使采取以手术为主、化疗和放疗为辅的方法进行综合治疗，其预后仍不理想[2]。目前，肿瘤转移仍然是肝癌患者死亡的最主要原因，也是困扰临床医师的主要问题之一[3]。天然黄酮类物质桔皮素（Tangeretin）广泛存在于芸香科植物川橘果皮、酸橙果皮和柑橘茎叶中，具有化痰消痞、理气和胃、抗真菌等功效[4-5]。近年来，大量体外研究证实了其可有效地抑制肝癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞的生长、增殖，并具有毒副作用较低的特点[6-9]，是一种具有潜在肝癌治疗开发价值的天然药物，但其作用机制尚不清楚。基于此，本研究旨在探究桔皮素对人肝癌HepG2细胞增殖和侵袭的影响并探讨其作用机制，为将桔皮素开发用于肝癌的治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

Multiskan FC酶标仪（美国Thermo公司）；IX73倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；7500实时荧光定量聚合酶链式（RT-PCR）分析仪（美国ABI公司）；高速离心机（美国Beckman公司）。

1.2 药品与试剂

桔皮素（南京科朗医药化工有限公司，批号：CS80005，纯度：98%）；CCK-8试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号：C0038）；Trizol总RNA提取试剂盒（武汉科昊佳生物科技有限公司，批号：15596026）；染料法荧光PCR定量（SYBR Premix Ex Taq）试剂盒（批号：RR820A）均购自大连宝生物公司；细胞侵袭试剂盒（美国Corning公司）；抗E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和内参β-actin抗体（美国Santa Cruz公司）；Notch-1、免疫细胞表面抗原（CD）44、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）和磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK-3β）抗体和辣根过氧化物酶标记兔抗人免疫球蛋白G（IgG）二抗（美国Cell Signaling Technology公司）；胎牛血清（FBS）和RPMI 1640细胞培养基（美国Hyclone公司）；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 细胞

人肝癌HepG2细胞系购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

2 方法

2.1 细胞的维持

将人肝癌HepG2细胞维持于含10%FBS及100 u/ml青霉素、100 mg/L链霉素培养液的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。待细胞长满后，常规更换培养液，0.25%胰酶溶液消化，以1∶2的比例传代。

2.2 细胞增殖试验

按照“2.1”项下条件进行细胞培养，待细胞长满后更换培养液，0.25%胰酶溶液消化后进行试验。将细胞分为空白对照组（即0µmol/L组）和药物处理组（10、20、40、60、80µmol/L桔皮素），每组设6个复孔，分别培养24、48 h后，每孔加入CCK-8溶液10µl，于37℃、5%CO2培养箱中继续孵育2 h后，酶标仪测定其在450 nm波长处的吸光度（A）。试验重复3次，取A平均值计算细胞的增殖率[增殖率（%）＝（药物处理组平均A值/空白对照组平均A值）×100%]；采用GraphPad Prism 6.0软件计算半数抑制浓度（IC50）。

2.3 细胞侵袭试验

按照“2.1”项下条件进行细胞培养，待细胞长满后更换培养液，0.25%胰酶溶液消化后进行试验。将细胞分为空白对照组（0µmol/L）和药物处理组（20、30 μmol/L桔皮素），培养48 h后，0.25%胰酶溶液消化，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，以无血清RPMI 1640培养基混悬细胞密度为5×105个/ml。取200µl细胞混悬液（相当于1×105个细胞）加至Transwell小室，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h。取出Transwell小室用棉签小心拭去基质胶及上室细胞，4%多聚甲醛固定10 min，结晶紫室温染色25 min。显微镜下随机选5个视野进行拍照计数，计算平均每个视野的细胞数，以穿过滤膜进入下室的细胞数来表示细胞的侵袭能力，侵袭抑制率（%）＝（药物处理组下室细胞数/空白对照组下室细胞数）×100%。试验重复3次取平均值。

2.4 蛋白印迹试验

细胞的培养、分组情况同“2.3”项下。培养48 h后，RIPA裂解液裂解细胞，以12 000×g、4℃离心10 min收集总蛋白。取40 μg总蛋白上样，经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，分别加入稀释比例为1∶2 000的抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-9抗体和稀释比例为1∶1 500的抗Notch-1、CD44、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β抗体以及稀释比例为1∶2 500的抗β-actin（内参）抗体，4℃孵育过夜。以辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG二抗室温孵育1 h，化学发光剂发光、显影，采用Quntity One软件进行各蛋白灰度值的测定。以目的蛋白条带灰度值与内参β-actin蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量，以p-Akt、p-GSK-3β蛋白条带灰度值与Akt、GSK-3β蛋白条带灰度值的比值表示Akt、GSK-3β的磷酸化水平。

2.5 RT-PCR试验

细胞的培养、分组情况同“2.3”项下。培养48 h后，采用Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度仪测定其浓度，并取2µg总RNA反转录合成cDNA。反应程序：94℃预变性3 min；95℃变性50 s，退火30 s，72℃延伸95 s，35个循环；72℃最后延伸5 min，结束反应。以GAPDH作为内参基因，采用2－ΔΔct法[10]计算目的基因的相对表达量。引物序列、退火温度及产物大小见表1。

表1 RT-PCR引物、退火温度及产物大小Tab 1 RT-PCR primer，annealing temperature and product length

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 桔皮素对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用

10～80µmol/L桔皮素培养细胞24、48 h后，细胞增殖明显受到抑制，并具有剂量和时间依赖性，细胞增殖率较空白对照组明显降低（P＜0.05）；且培养48 h后细胞增殖率较培养24后明显降低（P＜0.05），结果见图1。培养24、48 h后的IC50分别为55.7、23.4 μmol/L。

图1 不同浓度桔皮素作用不同时间后对人肝癌HepG2细胞体外增殖的影响注：与空白对照组比较，＊P＜0.05；与作用24 h比较，#P＜0.05Fig 1 Effects of different concentrations of tangeretin on in vitro proliferation of human hepatocellular carcinoma HepG2 cell after different periodsNote：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.24 h group，#P＜0.05

3.2 桔皮素对人肝癌HepG2细胞体外侵袭的抑制作用

20、30µmol/L桔皮素培养细胞48 h后，对细胞的体外侵袭有明显的抑制作用，并具有量效关系，细胞的体外侵袭能力分别下降至45.2%和22.1%，较空白对照组明显降低（P＜0.05），结果见图2。

图2 不同浓度桔皮素作用48 h后对人肝癌HepG2细胞侵袭能力的影响（×200）Fig 2 Effects of different concentrations of tangeretin on invasion ability of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells after 48 h（×200）

3.3 桔皮素对人肝癌HepG2细胞中肿瘤相关基因mRNA及其蛋白表达的影响

20、30 μmol/L桔皮素培养细胞48 h后，细胞中N-cadherin、Vimentin、Notch-1、CD44、MMP-9 mRNA及其蛋白表达均显著下调，E-cadherinin mRNA及其蛋白表达均显著上调，细胞中Akt、GSK-3β磷酸化水平降低，与空白对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。这提示Akt/GSK-3β信号途径在桔皮素抑制肝癌细胞侵袭中发挥着重要作用，结果见图3、表2、表3。

4 讨论

本研究通过CCK-8试验证实，10～80µmol/L桔皮素能明显抑制人肝癌HepG2细胞的增殖，且其抑制作用呈时间和浓度依赖性，培养24、48 h后的IC50为别为55.7、23.4 μmol/L。为了体现桔皮素作用肿瘤细胞的浓度依赖性，并显示出较好的抑制效果以便于观察，本研究选取桔皮素培养48 h后IC50上、下两个浓度（20、30 μmol/L）进行后续试验。Transwell小室模型在体外进行肿瘤细胞侵袭能力的检测，结果发现桔皮素显著抑制HepG2细胞的体外侵袭能力。

图3 不同浓度桔皮素作用48 h后人肝癌HepG2细胞中肿瘤相关基因蛋白表达的电泳图Fig 3 Electrophoretogram of protein expression of tumor related gene in HepG2 cells after treated with different concentrations of tangeretin for 48 h

表2 不同浓度桔皮素作用48 h后对人肝癌HepG2细胞中肿瘤相关基因蛋白表达的影响（±s，n＝3）Tab 2 Effects of different concentrations of tangeretin on protein expression of tumor related gene in HepG2 cells after 48 （h±s，n＝3）

表2 不同浓度桔皮素作用48 h后对人肝癌HepG2细胞中肿瘤相关基因蛋白表达的影响（±s，n＝3）Tab 2 Effects of different concentrations of tangeretin on protein expression of tumor related gene in HepG2 cells after 48 （h±s，n＝3）

注：与空白对照组比较，＊P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05

基因E-cadherin N-cadherin Vimentin Notch-1 CD44 MMP-9 p-Akt/Akt p-GSK-3β/GSK-3β 0 μmol/L（空白对照组）1.00±0.15 1.00±0.18 1.00±0.17 1.00±0.15 1.00±0.11 1.00±0.16 1.00±0.12 1.00±0.11 20 μmol/L 1.52±0.35＊0.54±0.14＊0.56±0.18＊0.49±0.11＊0.52±0.08＊0.45±0.08＊0.72±0.22＊0.68±0.16＊30 μmol/L 1.72±0.24＊0.47±0.09＊0.41±0.16＊0.40±0.11＊0.36±0.12＊0.35±0.13＊0.62±0.15＊0.58±0.18＊

表3 不同浓度桔皮素作用48 h后对人肝癌HepG2细胞中肿瘤相关基因mRNA表达的影响（±s，n＝3）Tab 3 Effects of different concentrations of tangeretin on mRNA expression of tumor related gene in HepG2 cells after 48 （h±s，n＝3）

表3 不同浓度桔皮素作用48 h后对人肝癌HepG2细胞中肿瘤相关基因mRNA表达的影响（±s，n＝3）Tab 3 Effects of different concentrations of tangeretin on mRNA expression of tumor related gene in HepG2 cells after 48 （h±s，n＝3）

注：与空白对照组比较，＊P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05

基因E-cadherin N-cadherin Vimentin Notch-1 CD44 MMP-9 0 μmol/L（空白对照组）1.00±0.11 1.00±0.08 1.00±0.07 1.00±0.01 1.00±0.10 1.00±0.04 20 μmol/L 1.52±0.11＊0.54±0.20＊0.56±0.13＊0.49±0.20＊0.52±0.12＊0.45±0.05＊30 μmol/L 1.72±0.14＊0.47±0.12＊0.41±0.12＊0.40±0.02＊0.36±0.11＊0.35±0.03＊

上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）在细胞侵袭过程中扮演着重要角色，其在EMT过程中使有极性的上皮细胞失去极性，转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞，使没有侵袭能力的细胞获得浸润能力并最终转移到其他组织和器官，从而使肿瘤形成局部浸润和远端转移。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin是最主要的EMT标志物。细胞中E-cadherin表达减少可导致细胞间连接解体以及细胞分散；N-cadherin以及细胞角蛋白细胞骨架转化为Vimentin后，细胞骨架重排，形成细胞-基质黏附，引起细胞表型的改变以及细胞运动能力增强。因此，阻断或逆转EMT过程有可能会成为肿瘤抗侵袭治疗的新途径。为了探讨EMT在桔皮素抑制人肝癌HepG2细胞侵袭的作用，笔者检测了EMT标志物的表达变化。本研究结果显示桔皮素可抑制N-cadherin和Vimentin的表达，而使E-cadherin表达量明显上升，这提示桔皮素可能通过抑制人肝癌HepG2细胞的EMT过程而抑制细胞的侵袭。

Notch信号通路广泛存在于多种生物体组织细胞中，是一种在进化过程中十分保守的信号转导系统，该通路对细胞生长、发育、凋亡等生物学行为有着重要作用[11]。跨膜受体蛋白Notch-1是Notch信号通路的关键蛋白。大量研究表明，Notch-1蛋白在多种肿瘤中异常表达，其与肿瘤的发生、发展以及肿瘤耐药过程关系密切[12]。MMPs是一组能够降解ECM的锌离子（Zn2+）依赖型内肽酶，是能够降解Ⅳ型胶原的重要基质蛋白酶之一。MMP-9已被证明在ECM降解、新血管生成、肿瘤细胞的生长和凋亡等重要过程，以及在肿瘤侵袭、转移的复杂过程中起了关键性的作用[13]。Notch-1可通过影响Akt-GSK-3β以及下游转录因子活性而调节MMP-9的表达。本研究结果显示，桔皮素可抑制人肝癌HepG2细胞中Notch-1的表达，而且Notch-1作用下游基因MMP-9的表达也明显受抑制，这提示桔皮素可能通过调控Notch-1的表达而抑制肝癌细胞的侵袭。

GSK-3β是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是Akt最早发现的直接底物之一。β-链蛋白（β-catenin）作为一种细胞骨架蛋白可在胞膜处与E-cadherin形成复合体，对维持细胞间黏附、防止肿瘤转移而发挥重要作用。Akt-GSK-3β信号途径参与细胞的生长分化、凋亡调控以及肿瘤发生发展过程。活化的Akt可以磷酸化GSK，从而拮抗β-catenin的降解，胞浆中β-catenin积聚使其浓度增高，下调E-cadherin表达，进而促进肿瘤细胞运动[14]，最终诱导了EMT，并促进肿瘤的侵袭和转移。本研究发现，桔皮素能抑制Akt和GSK-3β的活性，这提示桔皮素可通过调节Akt-GSK-3β信号途径抑制肝癌HepG2细胞的增殖和侵袭过程。

综上所述，本研究证明了桔皮素具有抑制肝癌HepG2细胞增殖和体外侵袭的能力，其机制可能为下调Notch-1表达、抑制细胞Akt-GSK-3β信号途径和上皮-间质转化而抑制CD44和MMP-9的表达。可见，桔皮素具有较好的抗肝癌细胞增殖和侵袭作用。本研究为桔皮素作为潜在的抗肿瘤药物应用于临床提供了实验基础和依据。

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（编辑：林 静）

Effects of Tangeretin on in vitro Proliferation and Invasion of Human Hepatocellular Carcinoma HepG2 Cells and Its Mechanism Study

SUN Zhixin，ZHANG Ying（Dept.of Emergency Ward，the First Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of tangeretin on in vitro proliferation and invasion of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells，and to investigate its mechanism.METHODS：After treated with 0（blank control group），10，20，40，60，80µmol/L tangeretin for 24，48 h，the rate of cell proliferation was detected by CCK-8 assay，and IC50was calculated.After treated with 0，20，30 μmol/L tangeretin for 48 h，Transwell invasion test was used to investigate the effects of tangeretin on cell invasion.The effects of tangeretin on mRNA and protein expression of E-cadherin，N-cadherin，Vimentin，Notch-1，CD44 and MMP-9 were determined by RT-PCR and Western blot assay.The phosphorylation of Akt and GSK-3β were investigated by Western blot assay.RESULTS：10-80µmol/L tangeretin significantly inhibited in vitro proliferation of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells in time and dose-dependent manner；proliferation rates of them were significantly lowered，compared to blank control group（P＜0.05）；IC50were 55.7，23.4 μmol/L after treated for 24，48 h.After treated with 20，30 μmol/L tangeretin for 48 h，cell invasion was inhibited in HepG2 cells；mRNA and protein expression of N-cadherin，Vimentin，Notch-1，CD44 and MMP-9 decreased significantly，while those of E-cadherin increased significantly；the phosphorylated levels of Akt and GSK-3β increased；there was statistical significance between them and blank control group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Tangeretin can inhibit in vitro proliferation and invasion of human hepatocellular carcinoma HepG2 cell，which may be associated with inhibiting the expression of CK44 and MMP-9 and signal pathway of upstream Akt-GSK-3β through up-regulating the expression of Notch-1 and inhibiting epithelial-mesenchymal transition.

Tangeretin；Human hepatocellular carcinoma HepG2 cells；Proliferation；Invasion；Epithelial-mesenchymal transition

R966

A

1001-0408（2016）34-4800-04

2016-02-15

2016-07-18）

＊副主任医师，硕士。研究方向：天然产物对肿瘤的抑制作用和机制研究。E-mail：zhix74@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.15