北极新奥尔松地区地衣内生真菌的抑菌活性

付少彬,闫 松,辛 庆,杨忠凤,孟庆峰

(1.遵义医学院 药学院,贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 公共卫生学院，贵州 遵义 563099)



基础医学研究

北极新奥尔松地区地衣内生真菌的抑菌活性

付少彬1,闫 松1,辛 庆1,杨忠凤1,孟庆峰2

(1.遵义医学院 药学院,贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 公共卫生学院，贵州 遵义 563099)

目的 探讨北极地衣内生真菌对3种致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 25923、大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC 25922和白色念珠菌(Canidiaalbicans)ATCC 10213的抗菌活性，为发掘新的抗菌物质奠定基础。方法 采用牛津杯法检测11株北极内生真菌对S.aureusATCC 25923、E.coliATCC 25922和C.AlbicansATCC 10213的抗菌活性。结果 筛选的11株北极地衣内生真菌中，北极内生真菌M227-2和L174-6对3种致病菌均显示较强的抑制活性，对E.coliATCC 25922、C.AlbicansATCC 10213、S.aureusATCC 25923的抑菌圈直径分别达到18.3、28.2、32.2 mm和15.1、26.3、16.3 mm。而其余菌株也对C.albicansATCC 10213均显示不同程度的抑制活性，11株内生真菌中有4株对C.albicansATCC 10213的抑菌圈直径超过20.0 mm。结论 北极地衣内生真菌对3种检测菌S.aureusATCC 25923、E.coliATCC 25922和C.albicansATCC 10213显示不同程度的抑制活性，尤其其中4株对C.albicansATCC 10213显示较强的活性，为下一步开发新的抗菌物质提供参考。

内生真菌；北极；地衣；抗菌活性；致病菌

自1929年发现青霉素以来，微生物一直都是药物先导化合物的重要来源。迄今为止，人们已从微生物中发现超过20 000个活性天然产物，其中已用于临床的微生物药物(抗生素、抗癌及抗病毒药物)有100余种[1-2]。特殊环境的微生物具有特殊的基因类型、生理机能和代谢产物，潜藏着极大的科学和应用价值而成为世界生物学研究的热点之一，近年来对天然药物的开发做出了巨大贡献[3]，极地微生物因其特有的原始性、新颖性及多样性，为新型先导化合物及新药的筛选与研发提供了新的探索思路[4]。南、北极地区自然环境独特，为了适应低温、干燥、高辐射等严酷环境，极地微生物在选择进化的过程中形成了独特的分子生物学机制和生理生化特征[4-5]，也形成了在环境适应方面独特的代谢特征[6-7]。因此极地地区被认为是潜在、重要的微生物资源库，也是产生新型生物活性物质、高生物活性生产菌株的潜在种源地[8-11]。被誉为地球表面分布最广的先驱植物之一的地衣[12-13]，也是北极陆地生态系统的优势种群，其对北极生态系统的环境产生了巨大影响。但是，与植物内生菌相比，关于地衣内生真菌的研究起步较晚，且研究多集中在地衣内生菌的多样性及分子系统学方面[14-15]。关于地衣内生真菌另一方面的研究是针对次生代谢产物方向，起步则更晚。据不完全统计，2013年国内外关于地衣内生真菌化学成分研究的文献30余篇，次生代谢产物193个，其中新化合物77个，新骨架化合物1个[16]，现在这些数据还在飞速增加。由目前已分离获得的地衣内生真菌的次生代谢产物来看，许多化合物都具有抗真菌、抗细菌、抗肿瘤、抗病毒或清除自由基等活性。本研究选择采自北极新奥尔松地区的地衣标本，分离地衣内生真菌100余株，随机选择其中11株，通过测量结果稳定、相对误差小的牛津杯法[17-18]对其发酵液的乙酸乙酯粗提取物进行3种标准菌株的抑菌活性初探，进而为下一步挖掘及开发抗菌物质提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 地衣样品 本文所涉及的地衣样品由中国医学科学院医药生物技术研究所张涛副研究员采自北极新奥尔松地区，采集后于-20 ℃冰箱保存，用于地衣内生菌的分离。

1.1.2 供试菌株 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 25923、大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC 25922、白色念珠菌(Canidiaalbicans)ATCC 10213，以上3种供试菌均由遵义医学院公共卫生学院实验室保存。

1.1.3 培养基 用PDA固体培养基进行内生真菌分离纯化，用PDB液体培养基进行内生真菌发酵培养。配方：去皮土豆200 g，煮沸20 min，8层纱布过滤得滤液，再在滤液中加入葡萄糖20 g和蛋白胨10 g，用自来水定容至1 L，即为PDB液体培养基；PDA固体培养基则在相应的液体培养基中1 L加入20 g琼脂。药敏试验培养基采用MHB和MHA培养基(购自青岛高博园生物技术有限责任公司)。所有培养基均在121 ℃灭菌25 min备用。

1.1.4 仪器 旋转蒸发仪(EYELA-N-110)购自日本东京理化器械株式会社；压力蒸汽灭菌锅(BXM-30R)购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；立式单人净化工作台(SW-CJ-IDLRH-250)购自苏州净化设备有限公司；恒温振-荡培养箱(TS-2102C)购自上海天呈科技有限公司。

1.1.5 试剂 乙酸乙酯、DMSO等溶剂均为分析纯，购自成都科龙化工试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 地衣内生真菌的分离 将地衣体用自来水洗净其表面灰尘，于75%酒精中浸泡5 min后，无菌水冲洗3～4次，再用0.1%的升汞漂洗30 s，无菌水冲洗5次，灭菌解剖刀切成0.5 cm长的小块接于配好的PDA平板上，同时将最后一次冲洗的无菌水取0.2 mL涂布于上述PDA固体平板上作为对照判断表面消毒是否彻底。于28 ℃下黑暗条件培养5～8 d。待地衣体组织块周围长出菌丝时，挑取菌丝转接到新PDA平板上纯化3次后，将纯化好的菌株接种于PDA试管斜面，保存于4 ℃冰箱备用，内生菌编号根据地衣体名字和编号进行编号，M和L开头分别代表不同的地衣体。

1.2.2 菌株发酵液粗提物的制备 将保存在PDA斜面的菌株活化2～3代，挑取菌丝接种到PDB液体培养基中，按10%接菌量接到100 mL三角瓶中(内装50 mL培养基)，在16 ℃、160 rpm震荡培养7 d，等体积乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液50 ℃减压浓缩得粗提物。

1.2.3 牛津杯法测地衣内生菌粗提物的抑菌活性

1.2.3.1 制备MH肉汤琼脂培养基 按说明称取MH肉汤琼脂培养基，溶于去离子水中并加热，使琼脂溶解，趁热分装入250 mL三角烧瓶，加塞后，放置于高压灭菌锅中，121 ℃下灭菌20 min，灭菌结束冷却至50～60 ℃，无菌条件下倒入9 cm无菌培养皿中，每皿约16 mL，加盖后待其彻底冷却至室温并凝固，备用。

1.2.3.2 菌悬液制备 取S.aureusATCC 25923、E.coliATCC 25922和C.albicansATCC 10213在平板上分区划线，置于37 ℃培养过夜，用灭菌接种环挑取单菌落在装有无菌水的试管内壁液面处研磨使菌种分散于无菌水中，振荡混匀，用麦氏比浊仪调节菌液浊度使菌悬液达到105CFU/mL。

1.2.3.3 牛津杯法测抑菌活性 用无菌棉签沾取上述菌悬液，在管壁轻轻挤压多余菌液，无菌操作在MH肉汤琼脂平板上涂匀、正置，待液体充分渗入培养基后，将灭菌的牛津杯轻轻放置在涂过菌的平板表面，轻轻按压，使之充分接触但不压破琼脂表面。取已过滤除菌的待测样品(乙酸乙酯粗提物用1 mL DMSO溶解)，取200 μL加入牛津杯中，盖上皿盖，37 ℃正置培养过夜，检查牛津杯周围抑菌圈的有无，以及测量抑菌圈直径，每个实验重复3次。

2 结果

从分离得到的北极地衣内生菌中随机挑选11株进行3种标准菌株的抗菌活性实验，50 mL发酵液乙酸乙酯提取物对S.aureusATCC 25923、E.coliATCC 25922和C.albicansATCC 10213的抑菌圈大小(见表1)，部分真菌粗提取的抑菌结果(见图1)。11株地衣内生真菌粗提物对S.aureusATCC 25923、E.coliATCC 25922和C.albicansATCC 10213均有不同程度的拮抗作用。11株北极地衣内生真菌中有2株抗菌谱较广，且对3种致病菌的拮抗效果均较好，分别是M227-2和L174-6，其中M227-2对S.aureusATCC 25923、E.coliATCC 25922和C.albicansATCC 10213的抑制圈直径达到32.2、18.3和28.2 mm，而菌株L174-6对S.aureusATCC 25923、E.coliATCC 25922和C.albicansATCC 10213的抑制菌直径分别达到16.3、15.1和26.3 mm。除了菌株M227-2和L174-6外，菌株L127-3对C.albicansATCC 10213抑制效果很明显，抑菌圈直径达到23.0 mm。11株内生真菌对C.albicansATCC 10213均表现出拮抗活性，菌株M227-2、L174-6、L125-4和L127-3对C.albicansATCC 10213抑制圈直径均超过20.0 mm。除了2株广谱菌株M227-2和L174-6外，其余内生真菌对E.coliATCC 25922表现出弱或者无拮抗活性。

表1 11株北极地衣内生真菌对3种检测菌的抑菌圈平均直径 (mm)

内生真菌大肠杆菌ATCC25922白色念珠菌ATCC10213金黄色葡萄球菌ATCC25923M227-218．3±0．128．2±0．132．2±0．1L174-615．1±0．226．3±0．216．3±0．1L03214．2±0．113．1±0．110．2±0．1L77-112．3±0．117．2±0．112．3±0．2L125-414．1±0．121．1±0．19．0±0．1L3042-211．2±0．113．2±0．212．3±0．2L156-412．1±0．215．3±0．19．1±0．1L127-313．0±0．123．3±0．121．0±0．1M2075-59．0±0．118．1±0．19．1±0．1M2967-99．1±0．118．3±0．29．0±0．0L245-710．2±0．111．2±0．19．1±0．1阴性对照9．09．09．0

A：M227-2和L174-6的抗E. coli活性；B：M227-2和L174-6的抗C. albicans活性；C：L127-3的抗E. coli活性；D：L125-4和L77-1的抗C. albicans活性；E：L127-3的抗C. albicans活性；F：M227-2和L174-6的抗S. auresns活性。图1 部分北极地衣内生真菌粗提物对检测菌的抗菌效果

3 讨论

我国是抗生素使用大国，临床应用药品中抗生素所占比例巨大。由于种类繁多、药物特征各异，临床抗生素合理应用存在较多困难，由此导致细菌耐药性快速增长。因此，新型抗菌药物的研发迫在眉睫。南、北极因其独特的环境造就了代谢产物结构和活性的多样性。近年来随着研究的深入，人们已从不同种类的极地微生物中发现越来越多的活性次级代谢产物，涵盖了生物碱类、大环内脂类、萜类、肽类、醌类、聚酮类等多种结构类型，表现出良好的生物活性，这些结构新颖、活性广泛的化合物的发现为药用微生物的代谢研究提供了宝贵的资源，也为药物研究提供了重要的先导化合物[18]。由于地衣是真菌与藻类的共生体，有着特殊的生活环境，近年来从地衣内生菌中分离的新颖化合物或活性代谢产物不断报道[19]。从极端环境发现活性代谢产物的研究也有越来越多[20]。但是从极地地衣内生菌中分离活性代谢产物的报道却很少。本文从北极先锋植物地衣中分离内生真菌百余株，进行3种检测菌S.aureusATCC 25923、E.coliATCC 25922和C.albicansATCC 10213的抗菌活性研究，从结果看，2株内生真菌的乙酸乙酯粗提物对3种致病菌均表现出很强的抑制活性，其余菌株对白色念珠菌C.albicansATCC 10213均有不同程度的抑制活性，有4株表现较强的活性。从结果可知分离自不同地衣体的内生菌菌株对于抗菌活性未表现出种属差异，M227-2和L174-6分别来自不同的地衣体却都表现出较强的广谱、强抗菌活性的特点。这提示北极地区地衣内生菌蕴藏着丰富的活性物质，有待进一步开发利用。课题组下一步将对活性菌株进行物种鉴定和活性跟踪分离，为开发新的抗白色念珠菌的化合物奠定基础。

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[收稿2016-06-15;修回2016-07-19]

(编辑：王 静)

Study on the antimicrobial activity of endophytic fungi from lichens of Ny-Alesund, Arctic

FuShaobin1,YanSong1,XinQing1,YangZhongfeng1,MengQingfeng2

(1. School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2. School of Public Health, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To screen endophytic fungi from lichen in Arctic with antibacterial activity ofS.aureusATCC 25923,E.coliATCC 25922,C.albicansATCC 10213 for new antimicrobial substances. Methods Oxford cup method was carried out to screen the active strains. Inhibition zone was used to evaulate the antibacterial ability of endophytic fungi. Results Of the eleven strains, M227-2 and L174-6 showed strong inhibitory activity against three pathogenic microbes with inhibition zone of 18.3, 28.2, 32.2 mm and 15.1, 26.3, 16.2 mm toE.coliATCC 25922,C.AlbicansATCC 10213, andS.aureusATCC 25923, respectively, while other strains showed inhibitory activity ofC.albicansATCC 10213 to some different degrees. Four of them showed high inhibition activity of which inhibition zones were more than 20.0 mm. Conclusion Endophytic fungi from lichen in Artic showed antagonistic activity againstS.aureusATCC 25923,E.coliATCC 25922,C.albicansATCC 10213.Four of them were effective againstC. albicans ATCC 10213.These fugi are promising for further research to develop new antibacterial substances.

endophytic fungi; arctic; lichen; antagonistic activity; pathogenic microbes

国家自然科学基金资助项目(NO: 21462057)；贵州省科技厅联合基金资助项目(NO: QKHLH-2014-7555)。

Q939.3；R931

A

1000-2715(2016)05-474-04