一氧化氮前体药JS-K安全性的初步观察

刘正芸，杨智文，徐尚福，勾 英2,,，周艳萌，刘 杰，王 欢2,,

(遵义医学院1. 基础药理省部共建教育部重点实验室；2. 贵州省普通高等学校传染病与生物安全特色重点实验室；3. 医学与生物学研究中心；4. 微生物学教研室，贵州 遵义 563099)



基础医学研究

一氧化氮前体药JS-K安全性的初步观察

刘正芸1,2,3，杨智文3，徐尚福1，勾 英2,3,4，周艳萌4，刘 杰1，王 欢2,3,4

(遵义医学院1. 基础药理省部共建教育部重点实验室；2. 贵州省普通高等学校传染病与生物安全特色重点实验室；3. 医学与生物学研究中心；4. 微生物学教研室，贵州 遵义 563099)

目的 一氧化氮前体药，JS-K体内外均具有良好的抗肿瘤效应, 但其毒性研究却鲜有报道。本文初步观察了小鼠长期口服和短期皮下注射JS-K的毒性，旨在为JS-K的后续研究提供毒性方面的实验依据。方法 雄性昆明小鼠40只，随机分为溶酶(等容量羧甲基纤维素钠，CMC)对照组、JS-K低(2.5 mg/kg)、中(5 mg/kg)和高剂量(10 mg/kg)组。连续口服给药3个月，观察小鼠的生长状况、体重，计算肝肾脏器指数，检测肝肾功能及肝肾组织病理学。另10只小鼠随机分为生理盐水对照组和JS-K 5 mg/kg组，每天皮下注射给药，连续5 d，检测小鼠骨髓和外周血造血干细胞的比率。结果 JS-K口服或皮下注射给药与对照组小鼠比较，给药和对照组动物在试验期间均生长状态良好、体重增加；肝和肾脏指数及肝肾功能与对照组之间无明显差异(P>0.05)，均在正常范围；HE染色没有发现JS-K产生明显肝肾毒性；小鼠骨髓造血干细胞中阳性细胞的比率，对照组2.19%，JS-K组1.98%；外周血造血干细胞中阳性细胞比率，对照组为0.110 6%，JS-K组0.128 3%，两组间无明显差异(P>0.05)。结论 小鼠连续口服JS-K 3个月(最高剂量10 mg/kg)没有发现对肝肾产生明显的毒性，对小鼠的生长未见明显影响；小鼠连续皮下注射JS-K(5 mg/kg)5 d，对骨髓造血功能没有明显的影响。

JS-K；一氧化氮；口服；皮下注射；毒性

一氧化氮(nitric oxide，NO)，是一种气体小分子物质，广泛参与机体的各种生理病理过程，如舒张血管、抑制血小板聚集、抗菌和抗肿瘤等[1]。由于NO的半衰期(3～5 s)很短，故对其前体药的研究越来越多，其中偶氮鎓二醇盐类NO前体药具有半衰期长(约20 h)，明显提高放疗疗效和诱导肿瘤细胞凋亡[2]等特点。JS-K，化学名称：O2-(2,4-dinitrophenyl)-1-[(4-ethoxycarbonyl)piperazin-1-yl]diazen-1-ium-1,2-diolate，是偶氮鎓二醇盐类NO供体代表药。大量文献报道JS-K在体内外对多种肿瘤，如多发性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌和白血病等都具有良好的抗肿瘤效应[3-5]，且对正常细胞没有明显的毒性作用[6]。同时，JS-K与化疗药物联用明显提高肿瘤细胞毒性，产生良好的抗肿瘤协同作用[7]。研究表明，JS-K通过耗竭细胞内的GSH和打破细胞的氧化还原平衡发挥作用[8]。目前，有关JS-K的毒性研究报道甚少，且仅局限于体外实验[9]。本文初步观察了小鼠长期口服JS-K和短期注射JS-K的毒性，旨在为JS-K的后续研究提供毒性方面的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性昆明(KM)小鼠50只，购自重庆第三军医大实验动物中心(许可证号：SCXK20080001)。

1.1.2 主要药品和试剂 JS-K由美国国家癌症研究所(National Cancer Institute, NCI)的Larry K. Keefer博士惠赠，分子量384，纯度99.9%；羧甲基纤维素钠(CMC)购于天津致远化工试剂有限公司，小鼠骨髓造血干细胞(LSK即Lin-Sca-1+c-kit+)相关荧光标记抗体及同型对照(IgG κ isotype control)购自美国eBioscience公司。

1.1.3 主要仪器 LQ-C6002电子天平(中国乐祺公司)，FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)，BX53显微镜(日本Olympus公司)，AU2700自动血生化检测仪(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药

1.2.1.1 口服实验 小鼠40只，体重(20±2) g。适应性喂养1周后，随机分为溶酶对照组(0.5% CMC)、JS-K低(2.5 mg/kg)、中(5 mg/kg)和高剂量组(10 mg/kg)(n=10)。小鼠灌胃给药，每天1次，连续3个月。每月取材1次，第1、2月末每次每组取小鼠3只，最后一次取4只。实验期间，小鼠每周称重1次，每天观察小鼠状态。

1.2.1.2 皮下注射实验 小鼠10只，体重(30±2) g。适应性喂养1周后，随机分为生理盐水对照组和JS-K给药组(5 mg/kg)，每组动物5只，每天1次皮下注射给药，连续5 d后取材。

1.2.2 脏器指数 处死小鼠后取肝脏和肾脏称湿重，计算脏器指数=脏器重量(mg)/ 体重(g)。

1.2.3 血生化指标 小鼠眼球取血后，1 500 rpm，离心20 min。取血清，置于1.5 mL去酶EP管中，用全自动生化仪检测丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)、碱性磷酸酶 (ALP)、尿素氮 (BUN) 和肌酐 (CREA)水平。

1.2.4 组织病理检查 取小鼠适量肝、肾组织，浸泡于10%的甲醛固定，行常规石蜡包埋、切片，苏木素(HE)染色，于显微镜下观察肝、肾的形态学结构。

1.2.5 流式细胞术检测JS-K对小鼠骨髓和外周血中造血干细胞比率的影响 小鼠末次给药2 h 后断头，取外周血于EDTA 2K+抗凝EP管中；并取单侧股骨，0.5 mL生理盐水冲洗骨髓制备骨髓单细胞悬液。股骨单细胞悬液和经EDTA 2K+抗凝的外周血100 μL与荧光标记抗体避光孵育30 min(外周血样本需红细胞裂解液去红细胞)，4 ℃，1 000 rpm，离心5 min，保留沉淀，PBS洗涤后用200 μL 1%多聚甲醛固定用于流式检测。

2 结果

2.1 小鼠体重 小鼠口服JS-K 2.5、5和10 mg/kg 3个月，通过连续观察可见试验期间小鼠状态良好，随着时间的推移体重稳定增加，与溶酶对照组相比，两组间差异无统计学意义(P>0.05) (见图1)。

图1 小鼠口服JS-K 3个月对体重的影响

2.2 脏器指数 计算脏器指数能反映药物对脏器的损伤。小鼠连续服用不同剂量的JS-K 3个月，溶媒对照组与各JS-K剂量组之间的肝肾脏器指数差异不具有统计学意义(P>0.05)，表明小鼠口服JS-K 10 mg/kg之内，对肝和肾脏没有明显的影响 (见表1)。

表1 小鼠口服JS-K3个月对肝肾脏器指数的影响

脏器指数给药天数(d)羧甲基纤维素纳(0．5%)JS-K浓度(mg/kg)2．5510肝脏指数3047．4±0．1251．8±2．6745．3±1．8041．4±1．706046．5±3．3343．4±8．2545．5±3．1240．2±4．339043．2±0．9849．5±2．7645．1±2．8645．2±3．79肾脏指数3015．4±1．8215．5±0．7815．9±2．8415．9±1．966015．7±0．4014．6±2．3314．2±1．6712．3±2．029015．5±0．6814．2±1．1814．5±1．4816．7±1．78

2.3 小鼠血生化检测 检测小鼠血清ALT、AST和ALP反映其肝脏功能；检测BUN和 CREA反映肾功能。小鼠连续口服不同剂量的JS-K3个月，与对照组相比，肝和肾脏功能无明显差异(P>0.05, 见表2)。

表2 小鼠口服JS-K3个月对血生化指标的影响

分组ALT(IU/L)AST(IU/L)ALP(IU/L)BUN(mmol/L)CREA(mol/L)羧甲基纤维素钠(0．5%)66．5±22．0207±26．5148±75．06．70±1．1069．5±9．22．536．7±14．6148±38．790±49．45．90±0．8081．0±0．6JS-K浓度(mg/kg)558．0±18．3175±28．5109±39．96．20±0．4073．8±14．71058．0±25．0195±75．9129±4．0 8．70±3．9078．5±28．9

2.4 肝、肾病理组织学检查 HE染色结果显示，各给药组和溶媒对照组小鼠的肝细胞排列整齐，结构完整，未见有明显的病变发生(见图2)。肾脏的HE染色可见各组肾小管和肾小球结构清晰，肾小球排列有序(见图3)。表明小鼠口服JS-K3个月没有引起肝、肾明显损伤。

A：羧甲基纤维素钠(0.5%)；B：JS-K低剂量组(2.5 mg/kg)；C：JS-K中剂量组(5 mg/kg)；D：JS-K高剂量组(10 mg/kg)。图2 小鼠口服JS-K3个月肝脏HE染色(×200)

A：羧甲基纤维素钠(0.5%)；B：JS-K低剂量组(2.5 mg/kg)；C：JS-K中剂量组(5 mg/kg)；D：JS-K高剂量组(10 mg/kg)。图3 小鼠口服JS-K3个月肾脏HE染色(×200)

2.5 皮下注射JS-K对小鼠骨髓和外周血中造血干细胞比率的影响 通过流式细胞术检测小鼠给药前后骨髓和外周血中造血干细胞的比率，图4可见给药组与对照比较，JS-K对小鼠骨髓和外周血造血干细胞的比率基本没有影响，说明5 mg/kg，连续皮下给药5 d对小鼠的骨髓造血功能没有明显的影响。

图4 皮下注射JS-K对小鼠骨髓和外周血中造血干细胞比率的影响(n=5)

3 讨论

本文通过长期(3个月)口服JS-K或短期(5 d)皮下注射JS-K，研究JS-K对小鼠是否有毒性。结果表明：无论是长期口服还是短期注射，JS-K对小鼠都未表现出明显的毒性作用。小鼠体重、肝肾脏器指数、血生化指标、HE染色、骨髓和外周血中造血干细胞比例等一系列实验结果的分析表明，JS-K对小鼠没有产生明显影响，说明本文的给药剂量对小鼠是安全的。

JS-K在抗肿瘤试验中所用的浓度比较小[1,8]，一般在1～1.5 mg/kg范围，且文献提供的给药方法多是注射。我们设计实验时考虑到用有效量的3倍以上剂量来观察其毒性。在注射剂量5 mg/kg和口服剂量2.5～10.0 mg/kg的范围内，JS-K均未显示明显的毒性作用。同时，也有文献报道，JS-K对正常的外周血单核细胞和骨髓间充质干细胞[5]、乳腺上皮细胞[1]以及人肾上皮细胞[6]没有明显毒性。

小鼠给予JS-K后没有表现出明显不适，厌食或消瘦的情况，无论是给药组还是对照组，其生长曲线显示小鼠体重随时间的延长稳步增长，各组间脏器指数也没有明显变化。

对于毒性实验，检测血生化指标和观察肝肾病理切片是普遍也是重要的实验手段，这两者都和机体的肝肾损伤密切相关[10-11]。本次实验结果显示：血生化指标ALT、AST和ALP各组间数值虽有差异，但不具有统计学意义(P>0.05)。BUN和CREA的数值波动不大，基本无变化；肝肾病理切片也未见明显肝肾毒性。

造血干细胞的存在对于机体至关重要，它能维持血液系统的稳定。同时，在特定环境下也能分化为其他组织细胞来维持机体的稳定[12-13]。目前，对骨髓抑制的研究多采用环磷酰胺(CTX)造模，剂量在100～150 mg/kg间不等，给药时间一般为5 d[14-15]。在本次实验中小鼠连续5 d皮下注射JS-K后，小鼠骨髓和外周血中造血干细胞的比例没有明显变化，这一结果也证明了JS-K对正常小鼠没有毒性作用。

目前做药物毒性实验，动物普遍选择雌雄兼用，这样能更好地观察药物的整体作用[16]。本次实验选用雄性小鼠进行相关毒性检测对实验结果的整体性有一定局限，但还是能说明关键的问题。

JS-K作为一种具有抗肿瘤效果的小分子化合物，由于其基本无毒的特性，因此具有较大的开发潜力。同时，本课题组也发现，JS-K在抗乙肝病毒方面具有一定效果[17]，因此深入研究JS-K的特性具有重要意义。

综上所述，本次实验结果显示口服JS-K 10 mg/kg，连续3个月或者皮下注射JS-K 5 mg/kg，连续5 d，对小鼠肝肾功能以及骨髓和外周血造血干细胞的数量无明显影响，这为JS-K的后期研究及开发提供了重要的实验和理论依据。

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[收稿2016-07-04;修回2016-09-10]

(编辑：王 静)

Preliminary safety studies on nitric oxide donors JS-K

LiuZhengyun1,2,3,YangZhiwen3,XuShangfu1,GouYing2,3,4,ZhouYanmeng4,LiuJie1,WangHuan2,3,4

(1. Key Lab for Basic Pharmacology of Ministry of Education; 2. Key Laboratory of infectious disease & Biosafety, Provincial Department of Education; 3. Research Center for Medicine and Biology; 4. Department of Microbiology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective The nitric oxide (NO) donor JS-K shows anti-tumor activity, but little is known about its safety. This study aimed to perform preliminary safety evaluation of JS-K.Methods To examine the long-term oral toxicity, Male mice were given solvent control (CMC), JS-K low (2.5 mg/kg), middle (5 mg/kg) and high dose (10 mg/kg) orally for 3 months. The general health of animals and the body weights were recorded. At the end of experiments, the liver and kidney index, serum biochemistry and histopathology were examined. To examine the potential bone marrow toxicity, mice received intraperitoneal injection of JS-K (5 mg/kg) for 5 days, and the effects of JS-K on bone marrow and peripheral blood hematopoietic stem cells were determined via labeling with special antibodies followed by flow cytometry analysis.Results The body weights were increased steadily with time in all groups, liver and kidney indexes and blood biochemistry parameters were all in the normal range (P>0.05). Hematoxylin and eosin stain showed no overt liver and kidney toxicity. The ratios of positive bone marrow stem cells of control were 2.19% and JS-K 1.98%. The ratios of positive peripheral blood hematopoietic stem cells in control were 0.111% and in JS-K 0.128%. The positive stem cells after injection with JS-K did not change.Conclusion Oral JS-K for 3 months (up to 10 mg/kg) did not show overt toxicity to liver and kidney, injection JS-K for 5 days (5 mg/kg, 4-fold of effective anticancer dose) did not affect bone marrow hematopoietic stem cells.

JS-K; nitric oxide; oral; subcutaneous injection; toxicity

国家自然科学基金资助项目(NO：81360261)；贵州省教育厅资助项目(NO：黔教合KY字[2015]331)；贵州省科学技术基金资助项目(NO：黔科合J字LKZ[2013]08)。

王欢，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：分子病毒学，E-mail：wanghuan928@163.com。

R335

A

1000-2715(2016)05-0464-06