不同虫花棒束孢菌株固体培养提取物抗氧化和抗菌活性初步测定

王永会, 郭宸昱, 王文婧, 蒋 岚, 李 熠, 吴红梅, 姚一建

1.中国科学院微生物研究所, 真菌学国家重点实验室, 北京 100101;2.中国科学院大学, 北京 101408;3.北京市第八中学, 北京 100033;4.福建农林大学植物保护学院, 福州 350002



不同虫花棒束孢菌株固体培养提取物抗氧化和抗菌活性初步测定

王永会1,2§, 郭宸昱3§, 王文婧1*, 蒋 岚1,2, 李 熠4, 吴红梅1,2, 姚一建1*

1.中国科学院微生物研究所, 真菌学国家重点实验室, 北京 100101;2.中国科学院大学, 北京 101408;3.北京市第八中学, 北京 100033;4.福建农林大学植物保护学院, 福州 350002

虫花棒束孢(Isariafarinosa)是一种常见的土栖昆虫病原真菌，在害虫生物防治方面有着广泛研究和应用，其对人体保健、药效和活性成分等方面也有一定的研究。为了揭示不同菌株之间的差异，选择7个来源不同的菌株，经形态和分子鉴定后，通过大米固体培养和乙酸乙酯提取，进行了抗氧化和抗菌活性测定。研究结果表明不同来源的虫花棒束孢菌株，经相同条件的培养和提取得到的产物在抗氧化和抗菌活性方面呈现明显的差异，以菌株2142表现最佳，在抗菌实验中尤其突出。菌株2142乙酸乙酯粗提物(200 mg/mL)对蜡样芽胞杆菌的抗菌活性达到与阳性对照氨苄西林钠(80 μg/mL)相似的水平。该菌株具有较好的应用前景，有待进一步深入研究。利用虫花棒束孢菌株研发保健产品或医药产品具有很好的潜力，但其菌株来源需要十分关注；筛选对人体安全可靠，并有利于产品开发利用的优良菌株是一项非常重要的工作。

虫花棒束孢；蝙蝠蛾拟青霉；乙酸乙酯粗提物；抗氧化活性；抗菌活性；菌株差异

虫花棒束孢 [Isariafarinosa(Holmsk.) Fr.]，常见异名为“粉拟青霉”[Paecilomycesfarinosus(Holmsk.) A. H. S. Br. & G. Sm. ]，在分类学上属于肉座菌目(Hypocreales),虫草菌科(Cordycipitaceae),棒束孢属(IsariaPers.)。虫花棒束孢是一种世界广泛分布的土栖真菌，寄生于鳞翅目、鞘翅目、半翅目、双翅目、同翅目及膜翅目等6目，并可能侵染几乎所有目的昆虫，是常见的虫生真菌[1,2]，具有广泛的生物防治应用前景[3]。研究也表明该菌对人体也具有多重药效作用，包括抗菌、抗氧化、抗肿瘤和增强免疫力等功效[3～5]。

有关虫花棒束孢的药效研究主要集中在多糖、水提取物和极性较大的成分等方面[3～5]，对其小极性成分的研究较少，而这一类代谢产物往往有更多不同的药效作用。如采用乙酸乙酯提取内生真菌Phomasp. 的固体培养物，获得的小极性成分具有明显的抑菌作用[6]；用各种有机溶剂提取药用拟层孔菌(Fomitopsisofficinalis(Vill.) Bondartsev & Singer)子实体，获取的小极性成分对肿瘤细胞有不同程度的抑制作用[7]；多孔菌(Polyporusvarius(Pers.)Fr.)发酵液乙酸乙酯提取的小极性成分对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)和大肠杆菌(Escherichiacoli)有显著抑制作用[8]；此外有研究发现药用真菌斑褐层孔菌[Fuscoporiapunctata(P. Karst.) G. Cunn]和苦白蹄[Fomitopsisofficinalis(Vill.) Bondartsev & Singer]小极性成分对肺癌A-549细胞具有明显的体外抑制增殖活性[9]。这些研究表明虫花棒束孢的小极性成分有待系统和深入的研究。

真菌的不同菌株和不同培养方式在代谢产物方面有所不同，在生物活性上也具有差异。对不同来源的拟青霉属(Paecilomyces)11种的29株菌株进行抗白色念珠菌(Candidaalbeicans)活性研究表明，菌株间的抑菌活性差异明显[10]；杨焱等[11]采用液体发酵、木屑固体发酵和米饭固体发酵3种培养方式培养桑黄(Inonotussanghuang)菌丝体，在体外抗氧化实验中表明，米饭固体发酵获得的提取物的活性明显高于其他两种方法。

本研究在可靠的分类鉴定基础上选择不同来源的虫花棒束孢菌株，通过大米固体培养和乙酸乙酯提取，进行抗氧化和抗菌活性测定比较，以揭示菌株之间的差异，为筛选具有应用前景的优良菌株和产品开发提供可靠信息。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

本研究采用来源不同的7个虫花棒束孢菌株，包括分离自虫花棒束孢解释模式的菌株CBS111113(购自丹麦CBS公司)和国内分离自罹病昆虫或土壤的菌株。国内的菌株主要来自青藏高原和北京(表1)。实验菌株采用PDA培养基在4℃下保藏。

表1 本研究所用虫花棒束孢菌株信息

Table 1 Strains ofIsariafarinosaused in this study.

菌株编号来源来源地备注1705昆虫北京本实验室分离1785昆虫青海本实验室分离2138昆虫四川本实验室分离2140冬虫夏草菌核云南本实验室分离2142土壤青海本实验室分离2185*冬虫夏草菌核云南本实验室分离CBS111113**昆虫丹麦购自CBS

注：*菌种来自蝙蝠蛾拟青霉新模式(蝙蝠蛾拟青霉已被证明与虫花棒束孢为同一物种，结果另文发表)；**菌种分离自虫花棒束孢解释模式。

供试病原指示菌株为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，CGMCC1.89)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus，CGMCC1.1846)、大肠杆菌(Escherichiacoli，CGMCC1.2385)及铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，CGMCC1.2031)，均由中国科学院微生物研究所菌种保藏中心提供。

1.2 菌株培养及样品制备

虫花棒束孢菌株在PDA培养基上经25℃黑暗培养14 d，用无菌水洗脱培养基表面的菌丝，制成106/mL的孢子悬浮液。将3 mL孢子悬浮液加入到含有150 mL马铃薯葡萄糖培养液的500 mL三角瓶中，在25℃下黑暗摇床振荡120 r/min培养5 d得到菌种液。取5 mL种子液接种于灭菌后大米固体培养基上(250 mL三角瓶中含30 g大米和40 mL蒸馏水)，于黑暗中25℃培养45 d。

各菌株各取8瓶大米培养物，捣碎成小块，每瓶加入200 mL乙酸乙酯浸泡，室温下提取过夜，收集提取液，剩余残渣中继续加入200 mL乙酸乙酯浸泡，共提取4次，合并提取液。在39℃下减压浓缩，吹干获得乙酸乙酯提取物，称重后4℃保存备用。

1.3 体外抗氧化活性测定

1.3.1 清除DPPH自由基能力测定 菌株固体培养物乙酸乙酯提取物自由基清除能力用DPPH测定法测定[12]。采用二倍稀释法，配置0.125～10 mg/mL系列浓度梯度的样品溶液。取一定浓度的150 μL样品溶液，加入2.85 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L)并立即混匀，室温避光放置24 h，波长515 nm处测定吸光值。相同体积的乙酸乙酯溶液为空白，相同浓度的BHT作为阳性对照。每个浓度设3个重复，按下式计算清除率：

第二，在历史人物形象和性格塑造上，民间口承叙事可以抛开正史中片面、单一的刻板记录，从多侧面丰富人物性格和人物形象，使历史人物更为饱满真实。以努尔哈赤的传说为例，在辽宁满族民间口承叙事中，将收录到的罕王传说按讲述内容的纵向时间罗列，可以清晰地勾画出努尔哈赤从出生、童年、历练，一直到成为一代帝王、建功立业的生命周期和“英雄式”叙事程式。

式中，Ab：空白吸光度；As：加入样品后的吸光度；Asb：样品本身的吸光度(不加DPPH溶液)。

式中，Ab：空白吸光度；As：加入样品后的吸光度。

1.4 抗菌实验

抗细菌活性测定采用滤纸片法。取活化后的受试菌液1 mL转至装有60 mL LB液体培养基的250 mL三角瓶中，在37℃下，180 r/min摇床培养5～6 h，取处于对数期的受试细菌，血球计数板调整细菌浓度为106CFU/mL。用移液枪吸取受试菌液100 μL于LB平板表面，用涂布器将菌液涂布均匀，静置1 h。

无菌条件下将干燥无菌的圆形滤纸片(d=6 mm)，分别放在阴性对照(乙酸乙酯)、受试样品(200 mg/mL)和阳性对照(革兰氏阳性受试菌株使用氨苄西林钠，浓度80 μg/mL；革兰氏阴性受试菌株使用链霉素，浓度80 μg/mL)中浸泡至充分吸收，再将其放置于均匀涂布受试菌液的培养基表面，滤纸片距平皿边缘1.5 cm以上，各滤纸片间距2.5 cm以上，每个平板3次重复。在37℃下培养24 h，观察细菌生长情况，并记录抑菌圈直径，根据抑菌圈直径大小判断样品对供试菌株的抗菌活性。

1.5 统计分析

试验数据采用SPSS 20.0处理。重复试验的结果用平均值±标准差表示。单因素试验在方差分析的基础上经Duncan’s多重检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 乙酸乙酯粗提物产量

经45 d固体培养之后，每个菌株从240 g(30 g/瓶× 8瓶)大米培养物所获得的乙酸乙酯粗提物得率差异很大，以菌株2142的得率最高，达大米培养基重量的1.031 1%，约为其他菌株的2倍；其次为菌株CBS111113，达0.618 1%，最低为菌株2138，仅0.397 3%(表2)。

表2 虫花棒束孢大米固体发酵物的乙酸乙酯粗提物产量

Table 2 The production of crude ethyl acetate extracts from inIsariafarinosarice medium.

菌株乙酸乙酯粗提物总量(g)粗提物得率(%)17050.97020.404317851.32560.552321380.95360.397321401.24580.519121422.47471.031121851.06230.4426CBS1111131.48340.6181

粗提物得率=粗提物总量/大米培养基用量

2.2 抗氧化活性研究

大米固体培养乙酸乙酯提取物清除能力(IC50值)(即对DPPH、超氧阴离子自由基清除率达50%时的提取物浓度，与清除率呈反比)均以菌株2142的提取物最低，而菌株2185 在DPPH自由基清除体系中的IC50值最高，菌株2138次之；且后两者的超氧阴离子自由基清除率均未达50%(表3)。

从具有IC50的乙酸乙酯提取物来看，不同菌株的培养物清除DPPH自由基的IC50值均小于清除超氧阴离子自由基的结果，即在两种抗氧化体系中，提取物对DPPH自由基有较好的清除作用。在7个不同来源的菌株大米固体培养的乙酸乙酯提取物中，1785、2142、CBS111113清除DPPH自由基的IC50值最低，三者之间没有显著差异，但与其他菌株相比差异显著(P<0.05)，拥有较强的清除能力；且2142在清除超氧阴离子自由基上与其他菌株相比具有显著性差异(P<0.05)，拥有较强的清除能力。

2.3 抗菌实验

乙酸乙酯提取物抗菌实验结果表明，各菌株对革兰氏阴性菌均未表现出明显的抗菌活性，而对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌)表现出一定的抗菌活性，但不同菌株之间差异明显，其中以菌株2142抗菌活性最为突出，尤其是对蜡样芽胞杆菌的抑菌圈直径与阳性对照相似；菌株2138未表现出任何明显的抗菌活性(表4)。

表3 不同虫花棒束孢菌株大米培养乙酸乙酯粗提物在两种抗氧化体系中的IC50值

Table 3 IC50values of crude ethyl acetate extracts fromIsariafarinosain antioxidant properties.

提取物IC50(mg/mL)DPPH自由基清除能力超氧阴离子自由基清除能力BHT0.086±0.000016f0.4734±0.00012e17052.50±0.19d6.35±0.09b17851.38±0.01e4.56±0.13c21385.26±0.05b—21404.51±0.07c7.93±0.18a21421.08±0.02e3.91±0.08d21856.0±0.81a—CBS1111131.23±0.02e5.02±0.10c

注：每一列的不同字母表示差异显著(P<0.05)；“—”表示最大清除能力未超过50 %，未参加方差分析。

表4 不同虫花棒束孢菌株大米培养乙酸乙酯粗提物抗菌活性

Table 4 Antimicrobial activity of crude ethyl acetate extracts from different strains ofIsariafarinosaon rice medium.

受试细菌抑菌圈直径(mm)#阳性对照阴性对照170517852138214021422185CBS111113革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)21.3±0.3a—9±1d8.6±0.26d—11.5±0.25c13.9±0.65b9.5±0.25d9.8±0.58d蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)12.7±0.3a—8.7±0.3b8±0b—8±0b12±1a8.3±0.3b8.7±0.3b革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichiacoli)21±0.3————————铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)11±0.5————————

注：#抑菌圈直径包括滤纸片直径(6 mm), 乙酸乙酯供试样品浓度为200 mg/mL；“—”表示没有明显的抑菌圈；每一行的不同字母表示差异显著(P<0.05)。

3 讨论

目前，虫花棒束孢在抗氧化和抗真菌活性等方面的研究取得了一定的进展[3]，但尚未见对虫花棒束孢大米培养提取物的抗氧化和抗细菌活性以及不同菌株之间比较的报道。本研究选择不同来源的虫花棒束孢菌株，在相同的大米培养条件下，进行抗氧化和抗菌活性比较。研究结果表明不同菌株差异显著，从乙酸乙酯粗提物的产量到抗氧化和抗细菌活性均表现出差异，并呈现一定的规律。菌株2142大米培养的乙酸乙酯粗提物的产量最高，在抗氧化的两个体系中IC50值均最小，在抑菌实验中对两种革兰氏阳性菌有最好的抑制效果，并达到正对照氨苄西林钠的水平。与此相反，菌株2138的乙酸乙酯粗提物的产量最少,在抗氧化的两个体系中IC50值最大或清除能力低于50%，并在抑菌实验中对所有参试菌株均无明显抑制效果。本研究结果表明，虫花棒束孢2142菌株具有较好的应用前景，有必要进一步展开研究，以确定其对人体的安全性、开发利用的方向和产品设计的类型等。

有报道采用平板培养菌丝获得乙酸乙酯粗提物的方法，比较了3株来自云南、北京和安徽不同寄主昆虫的虫花棒束孢(原文称“粉拟青霉”)菌株的清除DPPH自由基活性，在10 mg/mL浓度下，其平均清除率均未达到30%，而不同寄主、不同采集地的同一物种的不同菌株间清除自由基活性差异相对较小[10]。另外，通过比较43株不同来源的虫花棒束孢菌株液体培养菌丝体乙酸乙酯提取物的DPPH自由基清除能力，结果表明在30 mg/mL下，其自由基清除率普遍偏低，最高仅约20%，但不同菌株的自由基清除活性差别较大[13]。本研究通过比较7株来源不同的虫花棒束孢菌株，结果表明菌株之间差异很明显，且其大米固体培养的乙酸乙酯粗提物对DPPH自由基清除能力为50%时，其浓度均小于6 mg/mL。

虫花棒束孢是值得关注的真菌资源，因其寄主广泛和全球性分布的特点，用于农业害虫生物防治的研究非常之多。这个种的部分菌株可从我国名贵的食药用真菌冬虫夏草上分离获得，有些菌株已经开发成了药品或者保健品在市场上大量销售。因此，鉴于这个物种的复杂性，在保健或医药产品开发时要经过代谢产物、生物活性以及毒理方面的检测，以确保菌种的安全性。

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Antioxidant and Antimicrobial Tests of Extracts from Solid Culture ofIsariafarinosaStrains

WANG Yong-hui1,2§, GUO Chen-yu3§, WANG Wen-jing1*, JIANG Lan1,2, LI Yi4, WU Hong-mei1,2, YAO Yi-jian1*

1.StateKeyLaboratoryofMycology,InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China;2.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing10148,China;3.BeijingNo.8HighSchool,Beijing100101,China;4.CollegeofPlantProtection,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China

Isariafarinosais a widely distributed entomopathogenic fungus in soil-dwelling insects. It has been extensively studied and applied in biological control of insects, and also attracted researchers′ attention for its pharmacological effects and bioactive metabolites. In this study, seven strains ofI.farinosafrom different origins were selected based on morphological and molecular identification to reveal the variation among strains. Antioxidant effects and antimicrobial activities were tested by crude ethyl acetate extracts from the strains cultivated on rice medium. The results showed that the strains displayed significant variations in the bioactivities tested under the same conditions and strain 2142 had the best performance. In particular, the crude extract (200 mg/mL) from strain 2142 had the similar effect withBacilluscereusto that of ampicillin sodium (80 μg/mL) used as the positive control in the antimicrobial experiment. Further investigation on the strain was required to explore its potentials. There are broad prospects for the application ofI.farinosain health foods and pharmaceutical product, but the caution should be taken in the selection of strains for such purposes. It is important to evaluate the safety of any strain before its application in the area associated with human health.

Isariafarinosa;Paecilomyceshepiali; crude ethyl acetate extracts; antioxidant effects; antimicrobial activity; strain variation

2016-04-20; 接受日期：2016-06-06

国家自然科学基金项目(31170017);国家“十二五”科技支撑计划项目(2013BAD16B013)；青海省科学技术厅项目(2014-NS-524；2014-NS-525)资助。

§王永会与郭宸昱为本文共同第一作者。王永会，博士研究生，主要从事真菌活性代谢产物研究。E-mail：wangyhsdu@163.com。郭宸昱，中学生，科研实践项目为真菌活性代谢产物。E-mail：18910779039@163.com。*通信作者：王文婧，助理研究员，博士，从事真菌活性代谢产物研究。E-mail：wangwj@im.ac.cn;姚一建，研究员，博士，主要从事中国大型经济真菌相关研究。E-mail： yaoyj@im.ac.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.05.10