溃结宁膏穴位敷贴对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠血清及结肠组织促炎因子与抗炎因子的影响

王璇，朱莹，邹君君

湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005

溃结宁膏穴位敷贴对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠血清及结肠组织促炎因子与抗炎因子的影响

王璇，朱莹，邹君君

湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005

目的 观察溃结宁膏穴位敷贴对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎（UC）大鼠血清及结肠组织促炎因子干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-12与抗炎因子IL-4、IL-10的影响，探讨其治疗脾肾阳虚型UC的作用机制。方法 采用番泻叶溶液灌胃、喷冰水刺激和三硝基苯磺酸（TNBS）乙醇法制作脾肾阳虚型UC大鼠病证结合模型。将SD大鼠随机分为空白组、模型组、敷贴组、柳氮磺胺吡啶（SASP）组，每组10只，空白组和模型组予无药物的巴布剂基质穴位敷贴加生理盐水灌胃，敷贴组予溃结宁膏穴位敷贴加生理盐水灌胃，SASP组予无药物的巴布剂基质穴位敷贴加SASP灌胃，疗程均为28 d。治疗期间观察各组大鼠一般状况，治疗后肉眼观察结肠组织大体形态，HE染色镜下观察病理形态并评分，ELISA检测各组大鼠血清及结肠组织IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10水平。结果 敷贴组和SASP组UC大鼠一般状况、结肠组织肉眼大体形态、病理形态均较模型组好转且评分降低；与模型组比较，敷贴组、SASP组血清和结肠组织IL-4、IL-10水平明显升高，IFN-γ、IL-12水平明显降低（P＜0.01）；同时，敷贴组IL-4、IL-10下降水平低于SASP组，IFN-γ、IL-12上升水平高于SASP组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 溃结宁膏可能通过部分恢复大鼠血清及结肠组织促炎因子与抗炎因子的平衡来发挥其治疗脾肾阳虚型UC的作用。

溃疡性结肠炎；溃结宁膏；穴位敷贴；干扰素-γ；白细胞介素-12；白细胞介素-4；白细胞介素-10；大鼠

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种反复发作的肠道慢性非特异性炎症性疾病，以腹痛、腹泻、黏液脓血便为主要临床症状。研究表明，其具有一定的癌变倾向，目前尚未明确该病发病原因及机制，且缺乏确切的治疗手段，已被列为现代难治病之一[1]。我们前期研究表明，溃结宁膏穴位敷贴对脾肾阳虚型UC患者肠黏膜炎症有较好的改善作用[2-7]。本实验观察溃结宁膏穴位敷贴对脾肾阳虚型UC大鼠血清及结肠组织促炎因子干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-12与抗炎因子IL-4、IL-10的影响，初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性SPF级SD大鼠43只，2～3月龄，体质量180～220 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号SCXK（湘）2011-0003。室温（20±0.5）℃，相对湿度50％，自由饮食饮水，昼夜光照节律，适应性喂养1周后实验。

1.2 药物

溃结宁膏由炮附片、细辛、丁香、芥子、赤芍、延胡索、生姜等组成，本院药剂科提供并制成巴布剂；番泻叶，本院药剂科提供；无药物巴布剂基质由聚丙烯酸钠、明胶、高岭土、甘羟铝、蓖麻油、甘油、聚乙烯醇制成，本院药剂科提供；柳氮磺胺吡啶片，0.25 g/片，上海三维制药有限公司，批号20120615。1.3 主要试剂与仪器

2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS），美国Sigma公司，批号107K5008；IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-12 ELISA试剂盒，美国RD公司，批号201307；台式冷冻离心机，湘仪TGL-16；全自动酶标洗板机，汇松PW-812；酶标仪，汇松MB-530；电热恒温干燥箱，光都DHG-900Z-0；电子天平，江苏省武进市衡器厂RTZ-IOA-RT；S2-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；AO切片机，LEICA公司RM2235；光学显微镜，OLYMPUS公司BX50。

1.4 分组及造模

将43只SD大鼠随机分为空白组、模型组、敷贴组、柳氮磺胺吡啶组（SASP组），空白组10只，模型组、敷贴组、SASP组各11只。2 mL/kg 100％番泻叶溶液灌胃，1次/d，灌胃30 min后用喷雾器给大鼠全身均匀喷洒4 ℃冰水50 mL，湿润皮毛，然后将大鼠置于电风扇前吹干，复制大鼠脾肾阳虚证[8]。28 d后，将禁食12 h SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛4 mL/kg麻醉，将一直径2 mm、长12 cm的橡胶输液管插入肛门深约8 cm，将100 mg/kg TNBS乙醇溶液0.5 mL注入肛管，留置数分钟，让大鼠保持平躺状态，自然清醒，复制大鼠UC模型。第2日，在造模组中随机抽取1只处死，距肛门8 cm处取结肠组织，镜下观察组织病理形态，验证造模是否成功。

1.5 选穴与给药

选取“中脘”“气海”及双侧“足三里”“天枢”，定位参考《实验针灸学》[9]常用动物穴位定位法及拟人比照法。敷贴位置先用剪刀将毛剪短，再用剃毛器将毛剃净，每次剃毛4 cm2，贴药后予鼠夹固定。空白组和模型组均予无药物巴布剂基质穴位敷贴加生理盐水灌胃，敷贴组予溃结宁膏穴位敷贴加生理盐水灌胃，SASP组予无药物巴布剂基质穴位敷贴加SASP灌胃。各组于造模后第3日开始，予溃结宁膏敷贴或巴布剂基质处理，每日1次，每次1～1.5 h，后三里、天枢每次贴一侧，左右交替。SASP组用生理盐水配成10 mg/mL溶液，给药剂量为50 mg/（kg·d），给药体积为1 mL/d，空白组予等量生理盐水。每日1次，疗程为28 d。

1.6 取材

治疗28 d后大鼠禁食12 h，10％水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉，开腹暴露腹主动脉，腹主动脉采血5 mL，3000 r/min离心15 min，吸取上清液，检测血清IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10。距肛门6～l0 cm取肠段，冰生理盐水清洗，观察结肠组织有无充血、水肿，放入4％多聚甲醛，固定待做病理切片。取1 g结肠段，加PBS，用玻璃匀浆器研磨制成10％组织匀浆液，3000 r/min离心15 min，吸取其上清液，检测结肠组织IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10。

1.7 一般状况观察

2016年完成“抽油井工况分析表”发布，系统实现了泵效偏差、沉没率偏差计算结果的数字化和量化排序，从而及时发现潜力井，如图7所示。

实验期间每日观察大鼠饮水饮食、大便形状、腹泻和血便程度、懒动、拱背、嗜睡、背毛光泽、精神状态及活动等。

1.8 结肠组织病理学观察及评分

大鼠肠段于4％多聚甲醛固定后常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，镜下观察结肠组织病理学改变并进行双盲评分。按Sasaki等[10]评分标准加以调整，炎症严重程度以炎性细胞渗透程度进行半定量评分[11]。详见表1。

表1　结肠组织学评分标准

1.9 血清和结肠组织干扰素-γ、白细胞介素-12、白细胞介素-4和白细胞介素-10水平检测

ELISA检测血清和结肠组织IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10水平，严格按试剂盒说明书进行操作。

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，先进行正态性及方差齐性检验，符合者组间比较采用方差分析，不符合者采用秩和检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模结果

番泻叶灌胃3 d后大鼠均出现程度不同的血便，伴有大便稀溏、饮水饮食减少、消瘦、神态萎靡、毛色无光泽、懒动、扎堆等症状，说明脾肾阳虚证模型建立；TNBS乙醇溶液灌肠后麻醉处死3只大鼠，剖腹，分离结肠，肠系膜剪开肠腔，冰生理盐水冲洗，距肛门7～8 cm处均肉眼可见溃疡面，病理检查确认有充血、水肿、炎性细胞浸润、腺体破坏及典型的溃疡形成，说明UC模型复制。二者结合表明脾肾阳虚型UC大鼠模型造模成功。

2.2 一般状况观察结果

空白组大鼠一般情况基本正常，其余大鼠灌肠后24 h均出现不同程度的腹泻、血便、拱背、懒动、厌食；模型组大鼠均出现肉眼血便；敷贴组、SASP组大鼠在治疗第4日症状开始减轻，体质量逐渐增长；治疗第10日，敷贴组及SASP组大鼠症状明显改善，精神好转，饮食饮水增加，未见黏液血便，偶有稀便。

2.3 结肠大体形态

肉眼下空白组大鼠结肠黏膜未可见溃疡形成，模型组大鼠结肠壁可见明显充血、水肿，剪开肠壁可见肠壁黏膜有散在的溃疡点及糜烂，远端结肠为甚，直肠病变最为严重。敷贴组和SASP组大鼠肠黏膜病变较模型组明显好转。

2.4 病理观察结果

空白组大鼠肠黏膜未见溃疡形成，模型组大鼠肠黏膜可见溃疡形成，病变主要局限于黏膜层和黏膜下层，病变部位有大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润；敷贴组大鼠肠黏膜未见明显糜烂和溃疡，但仍有炎性细胞浸润；SASP组大鼠结肠病变有明显改善，肠黏膜无糜烂和溃疡，有少量炎性细胞浸润。结果见表2、图1。

表2　各组大鼠结肠病理组织学评分比较（±s）

表2　各组大鼠结肠病理组织学评分比较（±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01

组别 只数 评分空白组 10 1.400±1.265模型组 10 5.100±1.197**敷贴组 10 2.400±1.350**△△SASP组 10 2.100±1.337**△△

图1　各组大鼠结肠组织病理改变（HE染色，×100）

2.5溃结宁膏穴位敷贴对溃疡性结肠炎大鼠血清干扰素-γ、白细胞介素-12、白细胞介素-4和白细胞介素-10水平的影响

与空白组比较，模型组、敷贴组、SASP组大鼠血清IFN-γ、IL-12水平升高，IL-4、IL-10水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，敷贴组、SASP组大鼠血清IFN-γ、IL-12水平降低，L-4、IL-10水平升高（P＜0.05，P＜0.01），敷贴组、SASP组2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表3。

2.6 溃结宁膏穴位敷贴对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织干扰素-γ、白细胞介素-12、白细胞介素-4和白细胞介素-10水平的影响

与空白组比较，模型组、敷贴组、SASP组大鼠结肠组织IFN-γ、IL-12水平升高，IL-4、IL-10水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，敷贴组、SASP组大鼠结肠组织IFN-γ、IL-12水平降低，IL-4、IL-10水平升高（P＜0.05，P＜0.01），敷贴组、SASP组2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表4。

表3　各组大鼠血清IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10水平比较（±s，pg/mL）

表3　各组大鼠血清IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10水平比较（±s，pg/mL）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 只数 IFN-γ IL-12 IL-4 IL-10空白组 10 14.256±1.029 9.902±2.013 78.716±11.871 52.619±11.234模型组 10 24.119±1.308**27.840±2.386**42.819±17.695**17.629± 5.279**敷贴组 10 14.621±1.191**△17.290±1.658**△△76.393±11.423**△28.308± 6.012**△△SASP组 10 14.407±1.490**△△17.130±2.013**△△76.405±11.425**△△28.686± 6.062**△△

表4　各组大鼠结肠组织IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10水平比较（±s，pg/mL）

表4　各组大鼠结肠组织IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10水平比较（±s，pg/mL）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 只数 IFN-γ IL-12 IL-4 IL-10空白组 10 16.311±1.176 12.729±2.287 82.391±12.362 57.129±11.965模型组 10 25.207±1.093**29.597±1.948**46.946±17.716**21.695± 5.293**敷贴组 10 15.700±1.229**△△20.374±2.899**△△80.453±10.885**△32.339± 6.071**△△SASP组 10 12.575±0.964**△△19.457±2.353**△△80.492±10.892**△△31.367± 6.528**△△

3 讨论

目前认为UC主要与自身免疫紊乱、感染、遗传、神经精神等因素相关，并由其相互作用，导致肠黏膜的炎症、屏障破坏，形成溃疡。现代医学对UC发病机理的研究中较为公认的是免疫系统的紊乱——抗炎因子与促炎因子的失衡。

正常状态下，人体肠黏膜自发分泌抗炎因子及促炎因子并保持其动态平衡，以维持肠道正常免疫，当受到病原体刺激时，该平衡即遭到破坏，抗炎因子水平降低，促炎因子水平升高，导致炎症反应发生。现代医学研究表明，体内存在Th1和Th2细胞两类亚群，总体来说，具有促炎作用的是Th1细胞因子，发挥抗炎效应的是Th2细胞因子，它们共同发挥效应，并具有相互拮抗作用。Th1细胞主要表达IFN-γ、IL-12及IL-2驱动炎症反应，而Th2细胞主要表达IL-4、IL-10、IL-5、IL-6、IL-9和IL-13抑制炎症反应。IFN-γ的主要功能是免疫调节作用，是强有力的吞噬细胞和中性粒细胞激活物，促进T、B细胞分化，是IL-4的拮抗因子。IL-12能诱导早期辅助性T细胞分化为Th1细胞，并促进Th1细胞的发育和增殖。IL-4可刺激T、B细胞增殖，并抑制巨噬细胞和T淋巴细胞的产生和移动，且可抑制IL-1β、肿瘤坏死因子-α、IL-6、IL-8和一氧化氮的产生，在抑制和消除炎症中起重要作用。IL-10能抑制活化的T细胞产生细胞因子，尤其在抑制Th1细胞产生IL-2、IFN-γ方面作用明显，从而调节细胞免疫应答。既往研究表明，在UC患者中，IL-4减少非常明显，且其基因表达受到抑制[7]。同时也有实验显示，UC大鼠血清IL-4、IL-10含量明显降低，而血清IFN-γ、IL-12含量则明显升高[12-13]。

根据其临床表现，UC可归属中医“痢疾”“泄泻”“肠澼”等范畴，病因病机的认识主要集中在饮食不节、情志失调、湿热、脾虚或脾肾两虚等方面。朱莹教授认为，本病发作期以湿热、瘀血、积滞标实为主，静止期或慢性持续活动期则多以脾肾阳虚本虚为主，兼见湿热、瘀血、积滞等余邪，其病位在肠，与脾、肾密切相关，并据多年临床经验创制出溃结宁膏，具有温肾暖脾、活血化瘀之效，膏剂通过药物的透皮作用结合穴位治疗达到治疗的功效。

本实验结果显示，敷贴组和SASP组UC大鼠一般状况、结肠组织肉眼大体形态、镜下病理形态均较模型组好转。同时，敷贴组血清及结肠组织IL-4、IL-10水平明显升高，IFN-γ、IL-12水平明显降低，与SASP组比较差异有统计学意义，表明溃结宁膏穴位敷贴是通过上调抗炎因子IL-4、IL-10并下调促炎因子IFN-γ、IL-12的水平，恢复肠道免疫平衡，达到治疗UC的目的。

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Effects of Kuijiening Plaster Point Application on Pro- and Anti-inflammatory Cytokines in Serum and Colonic Tissue of Ulcerative Colitis Rats with Spleen-kidney Yang Deficiency

WANG Xuan, ZHU Ying, ZOU Jun-jun

(The Second Affiliated Hospital of Hunan University of TCM, Changsha 410005, China)

Objective To observe the effects of Kuijiening Plaster point application on the levels of pro-inflammatory cytokines IFN-γ, IL-12 and anti-inflammatory cytokines IL-4, IL-10 in serum and colonic tissue of ulcerative colitis (UC) rats with spleen-kidney yang deficiency; To investigate the possible mechanism of Kuijiening for the treatment of UC with spleen-kidney yang deficiency. Methods Sennae Folium solution gavage, ice water stimulation and trinitrobenzene-sulfonic acid ethanol combinative methods were applied to establish the models of UC rats with spleen-kidney yang deficiency. Rat models were randomly divided into control group, model group, application group and SASP group, 10 in each group. The control group and model group were given medicine-free cataplasm matrix point application and perfused with NS. The application group was given Kuijiening Plaster point application and perfused with NS. SASP group was given medicine-free cataplasm matrix point application and perfused with SASP. The courses were 28 days. General conditions of rats in each group were observed during treatment. The general morphology and pathological form of colonic tissue were observed with naked eye and light microscopy through HE staining respectively in each group post-treatment. Pathological features were observed and scored by HE dyeing. Levels of IFN-γ, IL-12, IL-4 and IL-10 in serum and colonic tissue of rats in each group weredetected with ELISA. Results The general conditions, gross morphology and optical microscope pathological morphology of colonic tissue improved and scores decreased in application group and SASP group. Compared with the model group, levels of IL-4 and IL-10 significantly increased, while the levels of IFN-γ and IL-12 decreased in serum and colonic tissue in application group and SASP group, with statistical significance (P<0.01). Moreover, levels of IL-4 and IL-10 in application group decreased not as much as those in SASP group, while IFN-γ and IL-12 concentration increased higher than SASP group, without statistical significance (P>0.05). Conclusion Kuijiening Plaster point application can play a role in treating UC with spleen-kidney yang deficiency through partially restoring the balance between pro- and anti-inflammatory cytokines in serum and colon tissue of rats.

ulcerative colitis; Kuijiening Plaster; point application; IFN-γ; IL-12; IL-4; IL-10; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.012

R285.5

A

1005-5304(2016)03-0042-05

湖南省教育厅重点课题（13A069）；湖南省科技厅课题（2013SK3080）；长沙市科学技术局项目（k1403023-31）

朱莹,E-mail：zhuying089@126.com

（2015-04-21）

（2015-06-18；编辑：华强）