电纺聚己内酯引导骨再生膜的仿生矿化研究

邓霞 白石

1.核工业四一六医院口腔科，成都 610051；2.重庆医科大学附属口腔医院种植科，重庆 400015

电纺聚己内酯引导骨再生膜的仿生矿化研究

邓霞1白石2

1.核工业四一六医院口腔科，成都 610051；2.重庆医科大学附属口腔医院种植科，重庆 400015

目的 探讨组织工程化电纺聚己内酯支架材料的生物矿化特性及其用作引导骨组织再生膜的可能性。方法 利用静电纺丝法制备聚己内酯（PCL）超细纤维膜支架，采用体外过饱和矿化液（SCS）浸泡法，在电纺膜上仿生沉积磷灰石。该复合材料采用扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射仪（XRD）、傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）等方法进行结构表征；采用接触角实验评价其亲水性；将成骨细胞与复合材料共培养，用SEM观察并评价其细胞相容性。结果 PCL电纺薄膜由超细纤维交织形成三维多孔结构，随着矿化时间增加，PCL电纺纤维上沉积的结晶物数量增多，形态增大并覆盖整个薄膜表面，形成磷酸氢钙及类骨磷灰石晶体。成骨细胞在复合材料表面黏附、铺展，呈正常生长形貌。结论 PCL电纺膜经过SCS处理是一种简便有效的制备复合材料的仿生矿化方法，该材料具有良好的细胞相容性，在仿细胞外基质组织工程化材料及引导骨组织再生膜研制方面具有一定的应用前景。

引导骨组织再生； 静电纺丝； 聚己内酯； 仿生矿化； 磷酸钙

Correspondence: Bai Shi, E-mail: 2296059@qq.com.

静电纺丝技术是一种简便易行的制备超细纤维的有效方法。纺织物具有较高的比表面积和高孔隙率，其微观结构与天然细胞外基质（extracellular matrix，ECM）相近，可以为细胞的生存提供良好的微环境，是较理想的组织工程支架[1]。目前已有胶原、壳聚糖、聚乳酸、聚己内酯（polycaprolactone，PCL）等数十种天然或合成的高分子材料[2]被应用于静电纺丝研究中。这些材料中，PCL是一种人工合成的聚酯类生物高分子材料[3]，安全无毒，生物降解性、力学性能、生物相容性均良好且具有形状记忆效应[4]，因此在生物医学领域具有诱人的应用前景。

引导骨组织再生（guided bone regeneration，GBR）是目前促进牙槽骨组织再生的有效手段，而GBR生物屏障膜是决定其临床效果的主要因素之一。近年来，学者们致力于研制能促使牙槽骨、牙骨质及牙周膜全方位再生的复合结构屏障膜，并赋予其生物活性、载药抗菌等复合功能来满足临床需要[5]。

仿生矿化是将生物矿化的方法引入材料合成的过程，以有机基质为模板，与无机矿物离子在界面处相互作用，对晶体的成核和生长进行分子调控，制造性能优良的有机-无机复合生物材料[6]。如何实现磷灰石微细晶体的快速沉积及均匀分布，一直是仿生矿化薄膜的研究热点。本实验结合静电纺丝法和仿生矿化法，将PCL电纺膜作为有机模板，利用氢氧化钙对其进行预处理，采用过饱和钙磷混和液（supersaturated calcification solution，SCS）仿生矿化法在PCL电纺超细纤维膜上快速矿化沉积磷灰石微晶体，制备GBR复合生物屏障膜，考察其仿生矿化特征，并进行初步的材料体外细胞学研究，为进一步研制在结构和功能上更适合颌面骨组织缺损修复的电纺PCL/磷酸钙（PCL/calcium phosphate，PCL/ CAP）复合生物屏障材料提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要原料及仪器设备

PCL（美国Sigma公司）；氢氧化钙、碳酸钠、无水氯化钙、碳酸氢钠、二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF），氯仿均为分析纯（成都市科龙化工试剂厂）。

THZ-C型恒温水浴摇床（江苏常州市万合仪器制造有限公司）；10-1-S型电热恒温鼓风干燥箱（上海喆钛机械制造有限公司）；AH250型电子天平（奥豪斯公司，美国）；高压静电纺丝机（四川大学纺织工程学院纺织研究所提供）；X’Pert Pro MPD 型X射线衍射仪（X-ray diffraction，XRD，Philips公司，荷兰）；Nicolet 510P型傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR，Nicolet公司，美国）；JSM-5900LV型扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM，JEOL公司，日本）；IX50/IX70型倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；OCA20视频光学接触角测量仪（北京东方德菲胶体化学仪器有限公司）。

1.2 PCL电纺膜的制备及表征

[7]配制PCL电纺溶液，将10 mL电纺溶液置于液体推注装置中，装置末端连接喷丝头（内径0.5 mm）。推注装置恒定以0.05 mL·min-1的加载速度将液体推出喷丝头。喷丝头同时与高压电源的正极相连，在喷丝头正下方放置玻璃盖玻片做收集板，并作为接地负极。在设定条件下制备电纺产物。样品喷金，SEM下观察电纺超细纤维的形态，采用SigmaScan Pro 2.0图像分析软件测量纤维直径。

1.3 PCL电纺膜的仿生矿化及检测

按文献[8]配制SCS仿生矿化液。将载有PCL电纺膜的盖玻片经新鲜配制的饱和氢氧化钙溶液浸泡，预矿化1 h，去离子水漂洗后， 37 ℃恒温浸泡于矿化溶液中。实验分组分别为12、24、48 h，矿化结束后，标本用去离子水漂洗，去除未反应的离子，自然干燥后送检。在SEM下观察形貌，用XRD及FTIR检测材料的物相分布。以滴躺法检测0.2 μL去离子水在纯PCL电纺膜及PCL电纺膜矿化12、48 h组待测材料表面的接触角，阐释其润湿性质。

1.4 成骨细胞与材料的复合培养

成骨细胞的分离培养采用刚出生3～5 d的SD乳鼠颅盖骨组织块法。将分离的SD乳鼠颅盖骨用PBS洗涤3次，用眼科剪剪成0.5～1.0 mm3的小块，放入含DMEM培养基的培养瓶中，加入4 mL DMEM培养液（含体积分数15%小牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1链霉素）。培养瓶置于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度孵箱中培养，6 h后翻转培养瓶。用倒置相差显微镜逐日观察细胞从组织块的游出及生长情况，平均每3 d更换1次培养液。当细胞增殖贴壁融合成单层后，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，经反复分瓶传代及细胞增殖致所需细胞量后备用。将试样放置于6孔板内，环氧乙烷冷消毒，PBS浸泡清洗 3次，每次 1 h，DMEM培养液孵育过夜。将第4代成骨细胞消化，制成密度为1×105·mL-1的悬浮液，分别接种于已备好的材料上，37 ℃条件下5%CO2孵箱内继续静置培养3 d。分别于第3 h、1 d、2 d将试样取出，10%多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯置换乙醇，临界点干燥，表面喷金，SEM观察。

2 结果

2.1 SEM形貌

在SEM下可见，电纺PCL膜由亚微米级超细纤维交织而成，具有高孔隙率及比表面积的特殊三维结构（图1A）。在SCS液中浸泡12 h，电纺PCL膜即有沿纤维分布的细小结晶物沉积（图1B）；随着矿化时间的延长，24 h组样品上的晶体体积逐渐增大，数目增多，但仍然可见PCL基体膜的网状结构（图1C）；48 h组样品上矿化结晶密集堆积，连接成片，覆盖整个基质表面，单个晶体呈叶片状，以原来形成的钙磷沉积为核心，增高增厚，相互交织成丛，形成花团状外形（图1D）。

图1 电纺PCL膜及在SCS中不同矿化时间后的形貌 SEM × 1 000Fig 1 Micrographs of electrospun PCL and the coated PCL scaffolds after immersing in SCS at different times SEM × 1 000

2.2 XRD及FTIR分析

XRD结果（图2）显示，21.53°、23.85°为PCL的特征衍射峰，25.9°、31°、33°为磷灰石特征衍射峰。PCL+SCS培养12 h组仅出现PCL的特征峰，磷灰石特征峰基本未显示；PCL+SCS培养24 h组，除了出现PCL的特征峰外，在25.9°和31°位置出现了磷灰石特征峰；PCL+SCS培养48 h组除PCL的特征峰外，在25.9°、31°和33°位置出现了磷灰石特征峰。将PCL+SCS培养48 h组样品与PCL基体膜作FTIR对比分析，在1 629 cm-1出现羰基特征振动吸收峰，在1 726 cm-1出现酯基特征振动吸收峰，在560、600、1 037 cm-1区出现PO43-的特征振动吸收峰，在1 417和1 464 cm-1处出现CO32–的特征振动吸收峰。

2.3 材料的亲水性接触角检测

经滴躺法测定，纯PCL电纺膜接触角为91°，液滴在材料表面呈球形；矿化12 h后接触角为23.5°，液滴明显铺展，但尚未完全浸润；矿化48 h后材料接触角为0°，液滴在材料表面完全浸润。

2.4 成骨细胞在复合材料上的生长

以48 h组样品的细胞培养为例，细胞接种于材料表面3 h后，细胞呈球形，其后逐渐伸出伪足黏附于材料表面（图3A）；1 d后，细胞变成纺锤形及梭形定植，伪足细长，仍可见细胞核部分隆起（图3B）；2 d后，细胞更加铺展，呈多角形，并相互交联（图3C）。成骨细胞在材料表面的黏附、铺展和生长行为符合正常生长形貌，提示该材料有良好细胞相容性。

图2 电纺PCL膜及在SCS中不同矿化时间后的XRD图谱 Fig 2 XRD pattern of electrospun PCL and the coated PCL scaf- folds after immersing in SCS at different times

图3 成骨细胞在PCL+SCS 48 h组复合材料上的生长情况 SEM × 1 000Fig 3 Osteoblasts cultured on PCL+SCS 48 h composite SEM × 1 000

3 讨论

GBR技术是膜引导性组织再生技术（guided tissue regeneration，GTR）在骨缺损修复领域中的应用[9]。随着该技术在牙槽外科、牙周科和口腔种植临床的广泛应用，对GBR生物屏障膜的要求也不断提高，根据屏障膜两侧组织再生的不同特点，学者们致力于研制更适合临床需要的不对称结构复合屏障膜，并赋予其生物活性和载药抗菌等多种功能[10]。

静电纺丝技术的发展与应用为制备理想的复合结构GBR膜提供了契机[11]。电纺纳米纤维膜的孔径为4～6 μm，而真核细胞直径范围为10～100 μm，因此电纺纤维膜的结构特点使其具有细胞屏蔽功能，非常适合制备隔离屏蔽膜。同时，电纺超细纤维直径与天然ECM（其中胶原纤维直径为50～500 nm）相近，支架具有极大的比表面积、较高的孔隙率和较好的孔道连通，因而被用作仿生人体内ECM结构的组织工程支架材料[2]。进一步优化制备工艺，将电纺材料多层叠加，修饰改性，形成具有优良性能的复合材料则是该领域新的研究热点。Bottino等[12]利用静电纺丝技术设计并制备了一种功能梯度材料，该材料具有中间基层和两侧不同的功能表层，综合了有机材料的良好机械性能、生物降解性和无机微粒的生物活性，兼顾了促进根端牙周膜组织再生和牙槽骨缺损侧骨再生的要求。因此，在电纺GBR膜阻挡软组织，发挥良好屏障功能的同时，在膜的骨缺损侧引入无机成分，增加材料的生物活性和骨诱导性，对骨组织的再生修复具有积极意义。

制备电纺有机-无机复合材料层有两种途径：一是将无机微粒如CaCO3和羟磷灰石直接加入电纺原液中，混纺形成复合材料[13-14]；二是将高分子电纺材料作为有机模板，在体外生物矿化[15-16]。前者的工艺过程中很难将无机微粒均质地分散于有机基质中，后者则更加体现了对天然骨组织中纳米磷酸钙在有机基质模板调控下的形态发生和有序组装的仿生设计。国内外已开展了大量模板仿生的研究。本研究采用体外仿生矿化的方式在电纺PCL基膜上沉积磷灰石，着重考察其矿化特性，为后续研制电纺PCL多层复合GBR膜提供实验基础。

仿生矿化常采用体外溶液浸泡法，以研究类骨磷灰石的形成。目前认为，液相仿生矿化至少需两个基本条件：其一是具有亚微米级的矿化成核生长点，即基质材料表面具有带有一定量负电荷的功能基团，有利于顺序吸附Ca2+和PO43-离子，为矿化物如磷灰石等的沉积提供成核位点，使矿化层与基质材料通过化学键相互结合；其二是具有过饱和钙磷离子浓度的微环境。一般的体外模型有模拟体液，交替矿化液及SCS[8,17-18]等。相比而言，SCS法矿化更简单、快捷、高效，本实验即采用该方法对PCL电纺三维支架材料进行生物矿化研究。由于PCL类可降解高分子生物材料表面疏水性强，细胞亲和性欠佳，表面缺乏诱导矿化的功能基团，如-PO4H2、-COOH、-OH、-CONH2、-NH2等，如何引入功能基团是对高分子材料仿生矿化的关键。在Kawashita等[19]的相关研究中，将羧甲基壳聚糖纤维预先处理，使材料表面暴露游离的羧基。在本实验中，采用饱和Ca(OH)2溶液浸泡PCL电纺三维支架，进行预矿化处理，酯基在水解过程中易开环形成游离的羧基，Ca(OH)2电离生成的部分Ca2+与游离的羧基络合；SCS中含有部分(PO4)3-，(PO4)3-取代羧基形成磷灰石晶核，并逐渐长大成磷灰石微细晶粒。饱和Ca(OH)2溶液预矿化处理，有助于PCL膜发生表面水解，提供更多的晶核形成位点促进了矿化结晶。本实验中，游离羧基与Ca2+形成的络合物是启动矿化成核的决定性因素。

XRD实验结果显示，PCL+SCS培养12 h组仅出现PCL的特征峰，磷灰石特征峰基本未显示，说明其结晶很差；PCL+SCS培养24 h组除PCL的特征峰外，在25.9°、31°位置出现了磷灰石特征峰，说明其结晶度优于PCL+SCS培养12 h组；PCL+SCS培养48 h组在25.9°、31°、33°位置出现了磷灰石特征峰，说明其结晶度优于PCL+SCS培养12 h及24 h组。随着矿化时间延长，PCL峰值依次降低，而磷灰石特征峰依次增高，提示PCL膜表面覆盖有更多的磷灰石晶体，磷灰石层的增厚增强了对PCL特征峰的吸收，强度下降。XRD分析结果与SEM观察结果完全一致。FTIR结果提示：磷灰石中含有碳酸根，表明该磷灰石为与天然骨相似的类骨磷灰石。

PCL电纺膜的SEM观察表明，随着时间延长，矿化结晶逐渐长大，密集分布，最终覆盖有机基体表面，其外形趋于稳定，成片状规则结晶。LeGeros[20]在无蛋白溶液中合成磷酸钙的研究表明，呈规则片状晶体的水磷酸氢钙是成骨和矿化过程的中间相，它在生理环境中能最终转化为片状类骨磷灰石。虽然SEM为磷灰石晶体形成提供了最直接的证据，但是根据晶体形貌判断晶体结构是初步的，因此本实验采用XRD、FTIR等其他方法进行进一步分析，证实其沉淀物为类骨磷灰石结构。

PCL电纺膜矿化前，其酯基为疏水基，呈现较强的疏水性，这对细胞的黏附与生长不利。经过矿化处理后形成的PCL/CAP复合膜，培养12 h组的样品，由于磷灰石晶体的吸附沉积，材料表面接触角明显变小，说明其可湿性提高；培养48 h组的矿化样品，液滴滴躺于其上很快直接铺展浸润，提示由于晶体增多，所以材料完全改性为亲水表面，与其他研究[21]结果相符。改性后的亲水表面不但利于蛋白质吸附，提高成骨细胞黏附性，还能改善材料的综合降解性能。因此，采用矿化48 h组材料作体外细胞培养，结果显示，成骨细胞在PCL/CAP材料表面展现黏附、铺展的生长形貌，初步提示材料具有细胞相容性，可作为多层电纺GBR膜的骨缺损侧内表层，为骨组织再生提供良好条件。

有研究[22]表明，在仿生矿化的材料表面，细胞相对增殖率明显提高，表示其具有良好的生物相容性。在本实验基础上，本课题组将进一步在细胞增殖分化、生物学功能的有效表达及载药抗菌等方面展开后续研究，设计研制更适合口腔颌面部骨组织缺损修复的电纺PCL/CAP多层复合GBR屏障材料。

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（本文编辑 吴爱华）

Biomineralization of electrospun polycaprolactone-guided bone regeneration membrane

Deng Xia1, Bai Shi2. (1. Dept. of Stomatology, Nuclear of Industry 416 Hospital, Chengdu 610051, China; 2. Dept. of Implantology, College of Stomatology, Chongqing University of Medical Science, Chongqing 400015, China)

Objective To evaluate the biomineralization of the tissue-engineering electrospun polycaprolactone (PCL) scaffold and its potential use for guided bone regeneration (GBR) membranes. Methods PCL ultrafinefiber scaffolds were fabricated by electrospinning and then immersed in supersaturated calcification solution (SCS) for biomineralization investigation. The electrospun PCL scaffolds and the calcium phosphate coating were identified by scanning electron microscopy (SEM), X-ray diffraction (XRD), and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Water-contact angles were also measured to evaluate the hydrophilicity of the modified surface. The biocompatibility of the composite was investigated by culturing osteoblasts on the scaffolds. Cell behavior was observed by SEM. Results The electrospun PCL scaffold was composed of ultrafine fibers and well-interconnected pores. The deposits on the fibers grew in number and size as the biomineralization time increased. Then, the covering of the whole PCL film was identified as dicalcium phosphate dehydrate and apatite. Good cell attachment and proliferation behavior were observed on the membranes. Conclusion The quick apatite formation on the surface of the PCL electrospun scaffold indicated that SCS biomineralization may be an effective approach for obtaining PCL/calcium phosphate composites. The cellular biocompatibility of the composite scaffold was preliminarily confirmed by the in vitro culture of osteoblasts on the scaffold. As such, the composite scaffold is a promising biomimetic extracellular matrix biomaterial for bone tissue engineering and GBR membranes.

guided bone regeneration; electrospun; polycaprolactone; biomineralization; calcium phosphate

R 783.1

A

10.7518/hxkq.2016.06.004

2016-04-10；

2016-10-08

邓霞，副主任医师，博士， E-mail：xiad520@sina.com

白石，主治医师，硕士，E-mail：2296059@qq.com