双芍护睛散对实验性外伤性视神经损伤保护作用的超微结构观察

肖家翔 文婷 姚莹



·实验研究·

双芍护睛散对实验性外伤性视神经损伤保护作用的超微结构观察

肖家翔 文婷 姚莹

目的 观察双芍护睛散对实验性外伤性视神经损伤保护作用的超微结构变化。方法 将实验SD大鼠60只随机抽取15只为空白对照组,其余45只造模后随机分为模型对照组、生理盐水组及中药治疗组,每组15只。空白对照组及模型对照组造模24小时后,生理盐水组及中药治疗组(双芍护睛散)用药4周后取左眼观察视神经的超微结构变化。结果 模型对照组视神经纤维排列紊乱,部分轴突肿胀,呈空泡样变性,髓鞘部分出现板层分离;生理盐水组视神经纤维排列紊乱,轴突变性而且数量减少,可见轴突脱髓鞘;而中药治疗组视神经纤维排列较规则,轴突数量轻度减少,可见髓鞘包裹轴突。结论 以养血行血法组方的双芍护睛散能抗视神经的损伤,促进视神经纤维的修复而保护视神经。

双芍护睛散; 视神经/外伤; 疾病模型; 动物

视神经萎缩(optic atrophy,OA)是视网膜神经节细胞及其轴索、视神经纤维由于各种原因所导致的功能障碍,是多种疾病的病理结果,为眼科常见的致盲眼病之一[1,2]。本病病因以外伤性、炎症性居多[3]。外伤性视神经损伤导致视神经萎缩的研究既往主要集中在解除视神经受压方面,而“神经保护”未得到足够的重视。临床上相当多的患者在视神经解压后已存在视功能的损害,表明在视神经受压时需及时对视神经进行保护性治疗,故本研究采用临床治疗视神经萎缩行之有效,以养血行血为法组方制成的双芍护睛散用于实验性外伤性视神经损伤,通过视神经的超微结构观察,以证实养血行血方有抗视神经损伤的作用,为开发有效治疗视神经萎缩中药制剂提供理论依据及实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选用健康3月龄SD大鼠60只,雌雄不限,体重200～250g,由贵州医科大学动物实验中心提供(合格证号:SCXK(黔)2013-017)。购进大鼠经手持裂隙灯检查双眼角膜透明,虹膜血管清晰,瞳孔对光反射灵敏,晶状体无混浊者纳入实验。将60只大鼠抽取15只为空白对照组,其余45只采用右眼视神经钳夹法建立视神经挤压伤模型,造模后随机分为模型对照组、生理盐水组及中药治疗组,每组15只。

1.1.2 药物

以养血行血法组方(白芍、赤芍、茺蔚子、桑葚、泽兰、牛膝、鸡血藤、川芎等),按现代中药制剂工艺制成双芍护睛散,由贵阳中医学院中药制剂室制备。

1.1.3 仪器

瑞典产LKBⅢ型超薄切片机;日本产JEM-1200EX透射电镜。

1.2 方法

1.2.1 造模

参照李云琴[4]方法进行造模:将需造模的45只大鼠于造模前3天用0.25%氯霉素眼药水滴眼,每日3次。造模时以3.5%水合氯醛作右下腹腔注射麻醉,并以1%盐酸丙美卡因对大鼠左眼进行表面麻醉。麻醉后,将大鼠固定于动物手术台上,沿左眼颞侧角膜缘将球结膜环形剪开,分离球结膜和巩膜,分离时避开外直肌,然后继续向后分离,打开肌锥后将视神经暴露出来,用钳夹力相等的视神经钳夹器夹于球后视神经2mm处,30秒后松开钳夹器,用8-0尼龙线缝合球结膜,造模完后以庆大霉素做球结膜下注射,以0.3%妥布霉素眼膏涂于结膜囊内,然后将大鼠保温至苏醒。观察造模眼的瞳孔情况,以瞳孔直接对光反射消失,间接对光反射存在者作为造模成功的实验动物纳入实验。

1.2.2 给药方法

中药治疗组及生理盐水组造模成功24小时后开始每日给药,剂量参照徐叔云主编的《药理实验方法学》[5]中关于人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表拟定,治疗组以双芍护睛散混悬液(每100ml含散剂30g)灌胃,剂量为5ml/Kg.d,每天2次;生理盐水组以等剂量生理盐水灌胃,每天2次。2周为一个疗程,停药2天后继续第二个疗程,共2个疗程。

1.2.3 标本制作及观察

空白对照组及模型对照组在造模成功24小时后;中药治疗组以及生理盐水组给药2个疗程后采用完全随机法随机抽取各组中的10只大鼠以10%水合氯醛过量腹腔注射处死,摘取左眼眼球,在冰上沿角膜缘剪开眼球后,去除晶体、玻璃体,保留球后视神经2mm,取过视盘约2cm×2cm的全层眼球壁。立即放于2.5%的戊二醛溶液中固定1h,磷酸盐缓冲液冲洗2h,用1%锇酸固定2 h,系列乙醇脱水,Epon环氧树脂812包埋,聚合350C、400C、550C各12 h,半薄切片(1μm)光学定位,以超薄切片机切片(70 nm),醋酸双氧铀枸橼酸铅染色,透射电镜主要观察视神经组织的超微结构。

2 结果

如图1所示,大鼠视神经的超微结构表现为:正常对照组视神经排列整齐,粗细均匀,轴突外有髓鞘包绕,髓鞘密度均匀,板层无分隔无断裂,轴浆分布均匀,胶质细胞胞浆内有大量线粒体及粗面内质网(图1A)。模型对照组视神经纤维排列紊乱,部分轴突肿胀,呈空泡样变性,轴突与髓鞘之间出现缝隙,髓鞘部分出现板层分离,结构紊乱,轴突内微丝显著减少,胶质细胞内线粒体重度肿胀,呈圆形或球形(图1B)。生理盐水组视神经纤维排列紊乱,轴突变性,数量减少,轴突内微丝明显减少,可见轴突脱髓鞘(图1C)。中药治疗组视神经纤维排列较规则,轴突数量轻度减少,可见部分正常的轴突,轴突内微丝轻度减少,可见髓鞘包裹轴突,形成新的神经纤维(图1D)。

3 讨论

视神经萎缩是由于各种病因造成视神经纤维变性丧失传导功能的最终结局。视神经由视网膜神经节细胞所发出的轴突纤维汇集而成。当视神经受损时,神经纤维会出现部分变细或者全部变细的形态学改变。外伤性视神经损伤引起视功能损害主要为视神经血流灌注不良而缺血,导致视网膜神经节细胞凋亡,轴突数量减少,视神经轴索运输中断,导致神经纤维受损,甚至萎缩。

视神经萎缩一度被认为是不可逆视神经损害结果,近年的研究改变了这种看法,有研究显示适当而积极的治疗对视神经萎缩的视功能可以得到一定的改善,并提出了残余视觉激活理论[6]。对视神经萎缩的治疗中西医均进行了较为广泛的探索。相关实验证明[7],受损的轴突在一定条件下,可得到一定程度的修复,从而促进神经纤维的再生。孔祥梅等[8]通过实验观察甲钴胺治疗视神经钳夹伤后大鼠,光镜和电镜下可见视神经轴突和神经节细胞异性改变明显减少,能有效减少视神经的退变及丧失。徐朝伟等[9]以明目复元汤联合中药穴位贴敷治疗急性视神经萎缩,其显效及总有效率高于口服肌苷片、腺苷钴胺片及维生素B12者。

图1 为视神经透射电镜照片(醋酸双氧铀枸橼酸铅染色×20000)。图1A为空白对照组,视神经排列整齐,轴突外有髓鞘包绕,轴浆分布均匀;图1B为模型对照组,视神经纤维排列紊乱,部分轴突肿胀,呈空泡样变性,髓鞘部分出现板层分离;图1C为生理盐水组,视神经纤维排列紊乱,轴突变性,可见轴突脱髓鞘;图1D为中药治疗组,视神经纤维排列较规则,轴突数量轻度减少,可见髓鞘包裹轴突

目前治疗视神经萎缩尚无确切有效疗法,本研究以中医理论为基,结合外伤性视神经损伤主要为视神经血流灌注不良而缺血,导致视网膜神经节细胞及轴突损害引发视神经萎缩的发病机制,提出目络瘀阻,目系失养的立法依据。针对外伤性视神经损伤有血 “亏滞”的关键环节,其治血一要养,二要行。故本研究选用临床有效治疗视神经萎缩,以养血行血为法组成的双芍护睛方制成散剂,用于实验性外伤性视神经损伤模型,通过视神经超微结构的观察以证实养血行血方对外伤性视神经损伤具有保护作用。研究结果显示,大鼠模型后视神经纤维排列紊乱,部分轴突肿胀,呈空泡样变性,髓鞘部分出现板层分离;应用生理盐水者视神经纤维排列紊乱,轴突变性而且数量减少,可见轴突脱髓鞘;而中药治疗组,视神经纤维排列较规则,轴突数量轻度减少,可见髓鞘包裹轴突。提示养血行血法组方的双芍护睛散能抗视神经的损伤,促进视神经纤维的修复而保护视神经。

[1] 张晓君.进一步提高视神经萎缩的诊断水平[J].眼科,2011,20(6):364-366.

[2] Dahlmann-Noor A H,Vijay S,Limb G A,et al.Strategies for optic nerve rescue and regeneration in glaucoma and other optic neuropathies[J].Drug Discovery Today,2010,15(7):287-299.

[3] 滕克禹,吕丽萍.视神经萎缩病因分析[J].中国中医眼科杂志,2013,23(6):428-430.

[4] 李云琴.大鼠外伤性视神经损伤模型的建立[J].眼科新进展,2011,31(10):934-936.

[5] 徐叔云.药理实验方法学.1版[M].北京:人民卫生出版社,2010:302-303.

[6] 魏世辉,张秀兰.正确认识视神经萎缩的治疗价值[J].中华眼科杂志,2012,48(12):1057-1058.

[7] 张世杰,王传富,孙为荣,等.视神经挫伤轴浆运输和超微结构变化的实验研究[J].眼科研究,2003,21(6):585-587.

[8] 孔祥梅,孙兴怀.甲钴胺对钳夹大鼠视神经的保护作用[J].眼视光学杂志,2004,9(6):157-164.

[9] 徐朝伟,潘小玲.明目复元汤联合中药穴位贴敷治疗急性视神经萎缩的临床观察[J].中国中医急症,2016,25(2):309-311.

To observe the effection of Shuang Shao Hu Jing powders on ultrastructural changes of optic nerves experimental and traumatic injury

XIAOJia-xiang,WENTing,YAOYing

(GuizhouProvinceHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guiyang,Guizhou,550001)

Objective To observe the effect of Shuang Shao Hu Jing powders on the ultrastructural changes of optic nerves in experimental traumatic models.Methods 15 SD rats were randomly drawn to the blank control group,and the other 45 were randomly divided into the model group,saline group and treatment group.we observe the optic nerves ultrastructural changes of the left eye,blank control group and model control group made after 24 hours,saline group and treatment group(treated by The Shuang Shao Hu Jing powde)for 4 weeks.Results The arrangement of optic nerve fibers of model control group were disorder,part of axons were swelling,and showed vacuolar degeneration,the part of myelin even appeared lamellar separation;The saline group,the arrangement of optic nerve fibers were also disorder,the axons were degenerate and the totall number of axon were reduced,axonal demyelination were also visible;The treatment group,the arrangedment of optic fibers were more regular,the number of axons reduced slightly,and the myelin wrapping axons could be observed.Conclusion The Shuang Shao Hu Jing powder conducted by blood nourishing and circulating method is effective to resist the damage the optic nerve,it can protect of the optic nerve by promoting the restoration of optic nerve fibers.

The Shuang Shao Hu Jing powder; Optic nerve/ traumatic injury; Disease models; Animal

贵州省社发攻关项目(黔科合SY字[2012]3087号)

550001,贵州贵阳,贵阳中医学院第一附属医院

肖家翔,Email:kate-show@163.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2016.03.004

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