温度和光照强度对银杏叶黄酮合成的影响

徐 友 ，王欢利 ，2，汪贵斌 ，曹福亮

（1. 南京林业大学 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2. 江苏省中国科学院植物研究所 南京中山植物园，江苏 南京 210014）

温度和光照强度对银杏叶黄酮合成的影响

徐 友1，王欢利1，2，汪贵斌1，曹福亮1

（1. 南京林业大学 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2. 江苏省中国科学院植物研究所 南京中山植物园，江苏 南京 210014）

为了探索温度和光照强度对银杏叶黄酮合成及调控机制，本研究对两年生银杏盆栽苗进行温度和光强的两因素三水平的处理，测定黄酮类黄酮类化合物的含量、代谢过程中关键酶基因表达量并建立黄酮类含量与基因表达的相关性，结果表明：T1Q3处理40 d后和T2Q2处理20 d后，单株银杏黄酮含量相较处理前显著增加；大部分处理中，黄酮类化合物的增量存在显著的温度效应，部分处处理中，黄酮类化合物的增量存在显著光强效应和温度、光强交互效应；黄酮代谢过程基因表达量存在显著或极显著的温度、光强及温度、光强交互效应；相关性分析表明；仅在处理10 d时，槲皮素的含量与F3H、FLS和ANS基因的表达量呈现明显的正相关。

银杏；温度和光照强度；黄酮类化合物；酶活性；基因表达

银杏叶中的黄酮类化合物具有广泛的生物药理活性，已成为医药和保健行业重要的原料。黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、消炎、抗肿瘤、抗心血管疾病、抗衰老和抗过敏等药理活性[1-2]。黄酮类化合物是银杏叶中重要的次生代谢物质，合成过程受环境条件的调控。因此，在银杏叶用园栽植管理的过程中，人为的改变环境条件即可提高黄酮类化合物的含量。目前，针对黄酮类化合物合成的环境因子的探究主要集中在光照、温度和水分三个方面[3-4]。然而研究的过程通常采用单因素处理，没有考虑到环境因子之间的交互效应。为了进一步探究温度和光强的交互作用，本研究测定不同处理下银杏黄酮类化合物含量、代谢过程中酶的活性及基因表量，进而了解环境因子的调控机制，为选择最佳的环境因子组合提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料选取江苏省邳州市1年生银杏实生盆栽苗，幼苗规格基本一致（平均苗高43.9 cm，地径8.66 mm）。盆栽容器直径为19 cm（径）×16 cm（高），每盆种植2株。盆栽基质为沙壤土（有机质含量为12.0 g·kg-1、水解性氮含量为 121 mg·kg-1、有效磷含量 12 mg·kg-1、速效钾含量为 11.7 mg·kg-1）。

1.2 试验设计

2013年3月，苗木栽植于盆中。2013年6月22日，盆栽苗木移入人工气候室。处理前对银杏苗进行正常的缓苗处理，缓苗期2周。缓苗结束后，开始进行温度和光强处理。光强设置3个梯度，分别为 300 μmol·m-2s-1（Q1），500 μmol·m-2s-1（Q2），800 μmol·m-2s-1（Q3）。温度设置 3 个梯度，分别为15 ℃/5 ℃（白天平均温度为15 ℃，夜间平均温度为5 ℃）（T1）；25 ℃/15 ℃（白天平均温度为25 ℃，夜间平均温度为15 ℃）（T2）；35℃/25 ℃（白天平均温度为35 ℃，夜间平均温度为25 ℃）（T3）。共计9个处理组合（表1），每个处理设3个重复小区，每个小区50盆银杏苗木。处理时间为40 d，处理期间，各处理土壤水分含量均保持在土壤田间持水量的75%。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生物量的测定

试验开始前和结束后，取20 株银杏苗，收集植株叶片放入烘箱中，在105 ℃杀青10 min，后用60 ℃烘干至恒重，称重，计算叶片总生物量，总干重增量和相对生长率。

表1 试验设计Table 1 Experimental design

1.3.2 黄酮含量的测定

银杏叶片黄酮及其各组分含量的测定：处理开始后的0 d、10 d、20 d、30 d和40 d，共计5次采样；采集植株当年生新梢中上部3-8片完全展开叶片，置60 ℃干燥箱烘至恒重，研磨过40目筛，并用万分之一电子天平准确称取1 g干燥备用。中有关银杏叶黄酮的提取和测定的方法（HPLC）参考《中华人民共和国药典》[5-6]。

1.3.3 黄酮代谢过程中相关基因的表达

处理开始后的0 d、10 d、20 d、30 d和40 d，共计5次采样。采样时摘取当年新梢叶片，采样取材时间集中在傍晚17:00左右，样品用酒精和蒸馏水擦拭干净，并用剪刀剪碎混匀，放入液氮中速冻0.5 h后，放入-70 ℃超低温冰箱保存待用。银杏总RNA的提取采用改良CTAB法[3]，反转录第一链的合成采用SuperScriptTM III Frist-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)，内参基因选择GAPDH基因，目标基因引物的设计采用Primer Express Software Version 3.0（Applied Biosystems），引物序列参见表2。

表2 银杏黄酮合成相关基因实时定量RT-PCR引物序列Table 2 The primers of flavonoids lactones biosynthetic genes in Ginkgo biloba for realtime PCR

1.3.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0 软件对试验数据进行处理和统计分析，用Duncan法进行差异显著性检验，用Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同处理下银杏单株黄酮含量

不同温度和光强的条件下，不同的采样时期银杏单株黄酮含量参见图1。不同处理间多重比较的结果表明：T1Q3处理40 d后和T2Q2处理20 d后，单株银杏黄酮含量相较处理前显著增加；在较低温度（T1和T2）下，处理10 d后单株银杏的黄酮含量显著下降；在较高的温度（T3）下，处理40 d后单株银杏的黄酮含量显著下降。

2.2 不同处理条件下黄酮类各组分方差分析

处理10 d时，样品中黄酮类化合物及各组分的增量在不同温度条件下差异均达到的极显著的水平，槲皮素增量的温度×光照交互效应达到了显著的水平（表3）；处理20 d时，黄酮类化合物及各组分的增量的温度效应达到了显著或极显著的水平，同时槲皮素、异鼠李素和总黄酮的增量的温度×光照交互效应达到了显著和极显著的水平；处理30 d时，异鼠李素增量的温度效应达到了显著水平，槲皮素增量的光照效应达到了显著水平，黄酮类化合物及各组分增量的温度×光照交互效应均达到了极显著的水平；处理40 d时，黄酮类化合物及各组分增量的温度效应和温度×光照交互效应均达到极显著的水平。

图1 不同时期银杏单株黄酮含量Fig.1 The contents of flavonoids in single ginkgo plant at different stages

表3 不同处理下黄酮类化合物增量的方差分析Table 3 ANOVA of increment of flavonoids under different treatments

2.3 不同处理条件下黄酮代谢过程中关键酶基因表达方差分析

处理10 d时，代谢过程中关键酶基因表达量的温度、光强及温度×光照交互效应均达到了显著和极显著的水平（表4）；处理20 d时，PAL基因表达量的温度效应不显著，而温度和温度×光照交互效应达到显著水平，C4H基因表达量的温度×光照交互效应不显著，而温度和光强的效应达到显著水平，其余基因的表达量存在显著或极显著的温度、光强及温度×光照交互效应；处理30 d时，FLS和ANS基因表达量的光强效应不显著，而温度及温度×光照交互效应显著，其余基因的表达量存在显著或极显著的温度、光强及温度×光照交互效应。处理40 d时，F3H基因表达量的温度和光强效应不显著，而温度×光照交互效应达到极显著的水平，其余基因的表达量均存在显著和极显著的温度、光强和温度×光照交互效应。

2.4 黄酮各组分的含量与代谢过程中关键酶基因表达量的相关性分析

在处理10 d时，槲皮素的含量与F3H、FLS和ANS基因的表达量呈现明显的正相关，山奈酚的含量与FLS基因的表达量呈现显著的正相关，总黄酮的含量与FLS基因的表达量呈现正相关（表5）；在处理20 d时，黄酮类各组分的含量与关键酶基因的表达为呈现明显的相关性；在处理30 d时，异鼠李素的含量与FLS基因的表达量呈现显著的负相关；在处理40 d时，总黄酮的含量与C4H基因的表达量呈现明显的负相关，异鼠李素的含量与PAL、C4H和CHS基因的表达量呈现明显的负相关。

表5 黄酮各组分含量与关键酶基表达量相关性分析Table 5 Correlation analysis between flavonoids and gene expression

3 结 论

不同温度和光照处理条件下，整个实验周期中仅在T1Q3处理40 d后和T2Q2处理20 d后，单株银杏的黄酮化合物的含量较处理前有显著的提高，并且在较低的温度条件下，处理10 d后，单株的黄酮含量显著下降。这种现象的主要原因可能有以下两个原因：（1）实验材料选择的是银杏两年生盆栽苗，尽管我们在实验初期尽量选取规格一致的实生苗。然而实验材料本身存在基因型的差异，然而在本实验中，笔者没有考虑到材料的遗传差异。（2）实验过程中温度和光强的设定较大田的生长条件明显偏低[3-4]，因此，在短时间的处理后，黄酮和内酯含量显著降低。

不同处理条件下，方差分析表明黄酮化合物存在显著的温度效应，而在部分黄酮类化合物存在显著的光强和温度×光强交互效应，因此在后续的实验过程中，我们可以通过设置较高的温度和光照条件，进一步探索银杏盆栽苗黄酮类化合物合成的最佳温度和光照条件，为银杏叶用园的经营管理提供指导[7-8]。

不同处理条件下，方差分析表明温度和光强显著的影响黄酮类化合物代谢过程中关键酶基因的表达，且温度和光强存在明显的交互效应；进一步的证实了光照和温度可以在转录水平调节关键酶基因的表达[9-10]。另外，黄酮类化合物的含量与代谢相关酶基因表达的相关新分析，仅在处理的初期阶段黄酮类化合物的含量与部分基因的表达呈现显著的正相关。主要的原因有（1）代谢过程中基因表达的调控的时间较短；（2）温度和光照对于黄酮类化合物合成的调控可能是通过多途径和多层次的的调控；（3）另外，在实验的过程中选取的实生苗做为实验材料，可能有于本身的基因型的差异。因此，综上所述，我们可以尝试通过对无性系植株进行温度和光强的的处理，从而提高银杏叶用园黄酮和内酯的含量。

[1]曹福亮. 中国银杏志[M]. 北京: 中国林业出版社, 2007.

[2]程水源, 顾曼如, 束怀瑞. 银杏叶黄酮研究进展[J]. 林业科学,2000, 36(6): 110-115.

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Effects of temperature and light intensity on flavonoid biosynthesis of ginkgo (Ginkgo biloba L.) leaves

XU You1, WANG Huan-li1,2, WANG Gui-bin1, CAO Fu-liang1
(1. Co-Innovation Center for the Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China;2. Nanjing Yat-sen Botany Garden, Institute of Botany Jiangsu Province & Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu, China)

In order to reveal the in fluence of temperature and light intensity on flavonoid biosynthesis in ginkgo leaves, two-year old ginkgo potted seedlings was treated under three levels of temperature and light intensities. The contents of flavonoid and key enzyme gene expression were measured then the correlation analysis of flavonoid contents and key enzyme gene expression was built. The result showed that flavonoid contents per plant were signi fi cantly increased at T1Q3 for 40d and T2Q2 for 20 d；In most treatments, the increment of flavonoid showed signi fi cant temperature effect, while just in few treatments, the increment of flavonoid showed signi fi cant light intensity and temperature´light intensity effect; the key enzyme gene expression contents showed signi fi cantly temperature, light intensity and temperature´ light intensity effect; there is remarkable positive correlation between quercetin contents and expression ofF3H,FLSandANSafter 10 d treatment.

Ginkgo bilobaL; temperature and light intensity; flavonoid; enzyme activity; gene expression

S792.95

A

1673-923X(2016)04-0030-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.04.006

http: //qks.csuft.edu.cn

2015-08-11

国家科技支撑计划项目“银杏用材和药用林定向培育关键技术研究”（2012BAD21B04）、江苏省科技支撑计划“沿海滩涂银杏用材林可持续性经营技术研究与示范”（BE2013443）、国家自然科学基金项目“银杏叶黄酮类化合物环境诱导机制”（31070557）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）资助

徐 友，博士研究生

汪贵斌，教授，博士；E-mail：gbwang@njfu.com.cn

徐 友，王欢利，汪贵斌，等. 温度和光照强度对银杏叶黄酮合成的影响[J].中南林业科技大学学报，2016, 36(4): 30-34.

[本文编校：吴 彬]