蛭丹化瘀组方对LPS诱导急性肺损伤大鼠炎性反应的影响

李慢中 王雅丽 李朝霞 赵 晖 沈 素 王丽丽 李 任

(1 首都医科大学中医药学院,中医络病研究北京市重点实验室,北京,100069; 2 首都医科大学附属北京友谊医院,北京,100050)



蛭丹化瘀组方对LPS诱导急性肺损伤大鼠炎性反应的影响

李慢中1王雅丽1李朝霞1赵 晖1沈 素2王丽丽2李 任2

(1 首都医科大学中医药学院,中医络病研究北京市重点实验室,北京,100069; 2 首都医科大学附属北京友谊医院,北京,100050)

目的:研究蛭丹化瘀组方对脂多糖(LPS)诱导的大鼠急性肺损伤的影响。方法:SD大鼠72只,随机分成对照组、模型组、蛭丹化瘀组方33、16.5、8.25 g/kg组、地塞米松阳性药组。气管滴注LPS制备急性肺损伤模型;HE染色,光镜下观察肺组织病理学变化并进行肺病理损伤评分;酶联免疫法检测各组大鼠肺组织炎性因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。结果:模型组大鼠肺组织病理损伤评分增高,肺组织炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6含量较正常组明显增加(P<0.01或P<0.05);蛭丹化瘀组方33 g/kg及地塞米松组大鼠肺组织病理损伤评分较模型组大鼠明显降低(P<0.05),蛭丹化瘀组方(33、16.5、8.25 g/kg)及地塞米松可明显降低肺组织TNF-α、IL-6含量,蛭丹化瘀组方16.5 g/kg还可明显降低肺组织IL-1β含量,差异较模型组明显(P<0.01或P<0.05)。结论:蛭丹化瘀组方能够减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤,其机制可能与降低肺组织中炎性反应因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量有关。

蛭丹化瘀组方;脂多糖;肺损伤;炎性反应因子

急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)是指由心源性以外的各种肺内、外致病因素导致的急性进行性呼吸衰竭,其病理基础主要表现为肺部炎性反应和肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞完整性破坏[1]。严重感染是引起急性肺损伤的重要因素,抑制炎性反应是治疗急性肺损伤的重要策略。目前尚缺乏特异有效治疗药物。因此,探讨和寻找治疗其有效药物的研究尤为重要。蛭丹化瘀组方由黄芪、川芎、制水蛭、牡丹皮、当归、赤芍、鸡血藤、组成,具有益气活血的功效,临床上多用于治疗小儿支原体感染及病毒性肺炎[1-2]。体外研究显示,蛭丹化瘀口服液体外有抗呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎支原体(MP)以及常见致病细菌如肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌的作用,整体实验显示,蛭丹化瘀口服液可辅助罗红霉素减轻支原体肺炎小鼠的病理损伤,减少血栓形成,改善微循环[3]。本研究通过建立ALI模型,评价蛭丹化瘀组方抗急性肺损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 蛭丹化瘀组方由黄芪、当归、赤芍、川芎、鸡血藤、水蛭、牡丹皮组成,经水提醇沉工艺制成组方颗粒剂的流浸膏,生药含量为4.85 g/mL,由北京中医药大学中药学院中药药剂教研室制备。醋酸地塞米松片,规格:0.75 mg/片,由天津力生制药股份有限公司提供,批号:140511;脂多糖,由Sigma公司提供,货号L2880;大鼠IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ检测试剂盒,由上海森雄科技实业有限公司提供。

1.2 动物 SD大鼠72只,雌雄各半,体重80～100 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证号:SCXK(京)2012-0001。

1.3 仪器 电子天平(型号:PL4001-L);Biofuge15R低温离心机(Heraeussepatech德国);JA-1003电子分析天平(上海精科天平厂);超细匀浆器(上海季诺科贸有限公司),水浴锅(型号:02810202,天津市中环实验电炉有限公司);Multiskan MK3型酶标仪(芬兰Thermo Labsystem公司)。

1.4 动物分组与给药 SD大鼠72只,雌雄各半,体重80～100 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证号:SCXK(京)2012-0001。大鼠随机分成6组,即对照组、模型组、蛭丹化瘀组方33、16.5、8.25 g/kg组、阳性对照组(地塞米松0.5 mg/kg)。除对照组、模型组灌胃给予等量生理盐水外,其他各组均灌胃给与相应药物,1 mL/100 g体重。1次/d、连续给药4 d。第5天给药后1 h进行模型制备。

1.5 LPS致肺损伤大鼠模型的制备 大鼠称重,按35 mg/kg剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉,仰卧位固定,沿颈部正中线切开皮肤,暴露气管,脂多糖(LPS)按7.5 mg/kg剂量,0.2 mL/100 g给药容积于气管内缓慢滴入(3 min),缝合创口。造模19 h后,灌胃给药,给药后1 h,取出肺组织,取右肺中叶称重,在无菌生理盐水中用玻璃匀浆器充分研磨,制成10%的组织匀浆,-80 ℃冻存备用。余肺、气管以10%福尔马林固定

1.6 肺组织病理学检查 肺组织固定24 h后,常规脱水,石蜡包埋，制作切片,切片厚5 μm,苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)染色,在Olympus光学显微镜下观察肺组织病理形态学改变。参照Mikawar[4]方法,进行肺组织病理学评分。对肺泡腔内出血、水肿;肺泡壁增宽;中性粒细胞浸润;支气管积脓;肺出血分别依病变轻重评分0～4分。0分:极轻度损伤;1分:轻度损伤;2分:中度损伤;3分:重度损伤;4分:严重损伤。将项指标得分相加作为总分。

表1 各组大鼠肺组织病理评分比较(±s)

表1 各组大鼠肺组织病理评分比较(±s)

注:与模型组相比,*P<0.05。

组别只数剂量(g/kg)组织病理学评分模型组9-4.67±1.12地塞米松组120.00052.40±1.56*蛭丹化瘀组方组11332.69±1.81*蛭丹化瘀组方组1116.54.22±1.39蛭丹化瘀组方组128.254.56±1.05

1.7 大鼠肺组织炎性反应因子测定 设标准孔8孔,每孔中各加入样品稀释液100 μL,第1孔加标准品100 μL,混匀后用加样器吸出100 μL,移至第2孔。如此反复作对倍稀释至第七孔,最后,从第七孔中吸出100 μL弃去,使之体积均为100 μL。第八孔为空白对照。将待测肺组织匀浆100 μL加入到预先已用抗大鼠IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ单克隆抗体包被的酶标板上;将反应板充分混匀后置37 ℃温箱120 min,使标准品、待测样品中的抗原与单抗充分结合;用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次,向滤纸上印干;每孔中加入生物素化的一抗(IL-1β/IL-4/IL-6/TNF-α/IFN-γ)工作液50 μL,置37 ℃温箱60 min;洗板;每孔加辣根过氧化物酶标记的Streptavidin抗体工作液100 μL,将反应板置37 ℃温箱60 min,使酶标抗体工作液与生物素化一抗结合成复合物;洗板;每孔加入OPD(邻苯二胺)底物工作液100 μL,置37 ℃暗处反应5～10 min;每孔加入1滴终止液(2M硫酸)混匀;在酶标仪上450 nm处测各孔吸光值。用curve expert1.3软件,IFN-γ以标准品4 000、2 000、1 000、500、250、125、62.5、0 pg/mL之OD值做出标准曲线,根据样品OD值在该曲线图上求出每mL组织匀浆中相应因子的含量。IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α以标准品1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、0 pg/mL之OD值做出标准曲线,根据样品OD值在该曲线图上求出每毫升组织匀浆中相应因子的含量。

1.8 统计学方法 运用SPSS 13.0进行数据统计分析,计量资料采用(±s)描述,行单因素方差分析(One-way ANOVA),组间两两比较采用LSD法进行,以P<0.05表示为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 蛭丹化瘀组方对内毒素致肺损伤大鼠肺组织病理学影响 HE染色结果显示,正常对照组大鼠肺组织结构清晰，肺泡腔清晰,肺泡壁未见异常充血,肺间质无炎性细胞。模型组大鼠病变主要表现为肺泡壁增厚伴炎细胞浸润,部分大鼠肺组织出现片状实变炎性反应灶,肺泡塌陷,肺泡出血。各治疗组大鼠病变特征与模型组相似,但肺泡损伤的程度较模型组不同程度减轻(图1)。肺组织病理学评分结果显示,地塞米松及蛭丹化瘀组方(33 g/kg)组大鼠肺组织病理学评分较模型组明显下降(P<0.05),蛭丹化瘀组方(16.5、8.25 g/kg)组大鼠肺组织病理学评分虽较模型组有下降趋势,但差异没有统计学意义(表1)。

图1 各组大鼠肺组织病理变化(HE×400)

2.2 蛭丹化瘀组方对内毒素致肺损伤大鼠炎性反应细胞因子的影响 模型组大鼠肺组织炎性反应因子TNF-α、IL-1β及IL-6含量较正常组大鼠明显增高(P<0.01或P<0.05),阳性药地塞米松及蛭丹化瘀组方(33、16.5、8.25 g/kg)可明显降低大鼠肺组织TNF-α及IL-6含量,差异较模型组明显(P<0.01);蛭丹化瘀组方16.5 g/kg组大鼠肺组织IL-1β含量较模型组显著性降低(P<0.05)。

表2 蛭丹化瘀组方对内毒素诱导肺损伤大鼠肺组织炎性因子的影响(±s)

表2 蛭丹化瘀组方对内毒素诱导肺损伤大鼠肺组织炎性因子的影响(±s)

注:与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01。

组别只数剂量(g/kg)TNF-α(pg/mL)IL-1β(pg/mL)IL-6(pg/mL)正常组9-23.07±3.23**76.70±41.96*38.82±20.60**模型组9-32.39±10.57118.28±45.7783.28±46.19地塞米松组120.000518.41±6.38**124.11±32.8544.71±18.17**蛭丹化瘀组方113316.69±5.20**102.60±42.3140.41±11.90**蛭丹化瘀组方1116.517.54±4.80**83.42±31.69*33.27±40.45**蛭丹化瘀组方128.2518.64±8.75**100.18±36.7939.53±44.04**

3 讨论

急性肺损伤是以肺泡-毛细血管膜的急性弥散性损伤为主要病理改变的危急重症[5],其主要原因与炎性反应细胞因子大量释放导致炎性反应瀑布样反应有关[6]。脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)是革兰阴性杆菌细胞壁的主要组成部分,其诱导的内毒素血症是急性肺损伤常见诱因。通过气管内滴入LPS,建立与呼吸道细菌感染的过程相似的急性肺损伤模型,是目前国内外普遍使用的模拟人类因感染诱发急性肺损伤的造模方法[7]。在LPS刺激下,中性粒细胞浸润入肺组织,激活的中性粒细胞释放炎性反应因子,引起炎性反应瀑布样反应[8]。在本次实验中,我们观察到大鼠气管内滴入LPS后可见肺间隔加宽,肺泡结构破坏,大量炎性反应细胞浸润等病理改变,说明内毒素致急性肺损伤模型成功。过度、失控的炎性反应是各种病因所致ALI的根本原因,LPS作为肺部炎性反应的重要促发因子,进入肺内与效应细胞表面TLR4和CD14受体发生特异性结合,启动多形核白细胞,释放各种炎性反应递质[9]。

作为炎性反应过程中的主要效应细胞,中性粒细胞激活后释肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白介素-1β(IL-1β)、和白介素-6(IL-6)等炎性反应细胞因子,破坏毛细血管内皮细胞及肺泡上皮细胞紧密连接,参与肺泡毛细血管膜损伤[10],相关报道表明TNF-α和IL-6的含量在急性肺损伤后2 h开始增加,并于6～24 h达到高峰[11]。TNF-α可损伤血管内皮细胞,增加其通透性,导致白细胞黏附、中性粒细胞脱颗粒并趋化到炎性反应损伤部位[12],IL-6和IL-1β可活化巨噬细胞、粒细胞,增强其活性,通常与TNF-α起协同作用[13]。本次实验结果表明,经气管内滴注LPS后,大鼠的肺组织呈现中性粒细胞浸润的病理改变,肺组织TNF-α、IL-6、IL-1β浓度明显升高,说明促炎因子释放是ALI发病的重要环节。蛭丹化瘀组方可明显降低肺组织炎性反应因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量,提示蛭丹化瘀组方可有效阻断促炎因子的炎性反应活化,对急性肺损伤具有良好的保护作用。

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(2016-02-29收稿 责任编辑：王明)

世界中医药学会联合会络病专业委员会中俄学术论坛在莫斯科召开

世界中医药学会联合会络病专业委员会中俄络病学术论坛于2016年4月20日在俄罗斯莫斯科胜利召开，来自中国境内及俄罗斯当地的共计200余名专家学者参加了本次论坛。

首先以岭药业营销中心王卫平总经理代表以岭集团，向远道而来的参会专家表示热烈的欢迎和衷心的感谢。

秦树坤秘书长助理出席开幕式并讲话，对各位专家的出席表示欢迎。他向与会专家介绍了世界中联成立以来在学术发展、团队建设、中医药标准化、国际化推广等方面做出的积极贡献。他指出络病专业委员做为世界中联的一个分支机构应继续围绕学会总体发展目标，为中医药的国际发展作出更大贡献。

络病专业委员会尹宏军副秘书长代表络病专业委员会，介绍了专业委员会成立以来的发展情况。并指出专委会将继续遵循世界中联分支机构发展的宗旨和任务，做出更多努力。尤其是专委会在学术发展方面已经做出了一定的成绩，每年一届的国际络病学术大会以及区域学术论坛，为中医络病学的国际推广做出了贡献。

上海复旦大学附属华山医院傅晓东教授，在会上做了动脉粥样硬化中西医结合治疗的主题报告，他指出动脉粥样硬化是不可避免的，不稳定斑块是心脑血管病发生的根本，降低ASCVD风险和事件已被临床诊疗指南推荐为治疗的最终目标。并通过循证医学研究证明，通心络胶囊与他汀类联合治疗动脉粥样硬化可进一步降低心血管事件的发生率，降低用药不良风险。

中日友好医院专家侯丕华教授，就中药整合调节-安全有效治疗心律失常向与会专家做了报告，她指出现代医学对心律失常的治疗采用单纯的阻抑对抗治疗方法，存在诸多不尽人意的问题；调律是心律失常治疗的新策略，如循证医学研究证实参松养心胶囊在心功能不全伴室性早搏、窦性心动过缓伴室性早搏等西医治疗棘手的问题上体现出非常好的疗效，治疗心律失常方面的安全性也要优于西药。

与会专家还前往北京中医药大学圣彼得堡医院中医中心进行了考察，俄方专家尤里·阿纳托利耶维奇就针灸治疗神经官能症在俄罗斯的临床应用做了报告,并与大家就中医药在俄罗斯当地的发展进行座谈。

本次论坛学术氛围浓厚，得到了与会专家积极响应。

Effects of Zhi Dan Hua Yu formula on inflammation of acute lung-injured rats induced by LPS

Li Manzhong1，Wang Yali1，Li Zhaoxia1，Zhao Hui1，Shen Su2，Wang Lili2，Li Ren2

(1SchooloftraditionalChinesemedicine，BeijingKeyLabofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069,China; 2BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050,China)

Objective:To observe the effect of Zhi Dan Hua Yu formula on acute-injured lung of rats induced by LPS.Methods:A total of 72 SD rats withhalf males and half females were divided into control group,model group,Zhi Dan Hua Yu group(33 g/kg,16.5 g/kg,8.25 g/kg)and dexamethasone group by random.Acute lung injury induced by instillation of LPS; HE staining; to observe the pathological changes of lung tissue and give a pathological score of lung injury by light microscope; to detect the content of lung tissue inflammation factor interleukin-1 beta(IL-1)and interleukin 6(IL-6)，tumor necrosis factor alpha(TNF alpha).Results:Compared with normal group，the Model group rats lung tissue pathological score were increased，TNF-a，IL-1 and IL-6 were significantly increased(P<0.01).compared with the model group rats zhidanhuayu prescription 33 g/kg and dexamethasone group rat lung tissue pathological score were significantly decreased(P<0.05).dexamethasone and zhidanhuayu prescription(33，16.5，8.25 g/kg)can significantly reduce the lung tissue TNF alpha，IL-6.zhidanhuayu prescription 16.5 g/kg also can significantly reduce the content of IL-1，which is more obvious than that of model group(P<0.01).Conclusion:Zhidanhuayu formula could reduce the acute lung injury induced by LPS，the effect mechanism may be related to the decrease of TNF-a，IL-6 and IL-1 content.

Zhidanhuayu prescription; Lipopolysaccharide; Lung injury; Inflammatory factors

北京市科学技术委员会“十病十药”研发项目(编号:Z141100002214019)——“蛭丹化瘀组方用于治疗小儿病毒性肺炎的成药性研究”

李朝霞(1977.09—),女,博士研究生,讲师,研究方向:中药新药与新剂型的研究,E-mail:gmacli@139.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.034