外植体的选择对果树叶片离体培养的影响研究

外植体的选择对果树叶片离体培养的影响研究

本文从外植体的基因型、叶片的发育程度、叶位及叶片切割方式等多方面对果树叶片组织培养的影响因素做了有关论述，旨在对果树叶片组织培养的研究方法及影响因子做一个比较系统的概述。

果树叶片；离体叶片；外植体

植物的叶片是进行光合作用的主要部位，其因体量大、获取方便等原因常常被作为植物离体培养的外植体来源。叶片离体培养的成功在植物基因克隆研究领域具有重要意义。在果树学领域，随着生物技术的不断发展，利用叶片进行离体再生技术，已经在变异筛选、引种、性状保存、繁殖育种及转基因工程等方面得到广泛的应用。本文就外植体的选择情况对果树离体叶片培养再生技术方面的影响做了详细综述。

1 外植体基因型对果树叶片离体培养的影响

植物离体培养的情况首先受其基因型的限制。外植体的基因型是决定其离体再生能力的根本因素，具体表现为种和种以及品种之间再生能力的差异。时保华、赵政阳、孙清荣、达克东等均对不同苹果品种的叶片离体培养再生能力进行过比较试验，结果表明：不同苹果品种的不定芽诱导需不同的生长激素配比和组合，适合叶片分化的条件因品种而异。Nehra等在研究草莓叶片离体再生试验中，发现在供试的10个品种中，相同条件下只有“Redcoat”品种获得高频率再生芽，其不定芽再生率高达94%，这说明草莓叶片直接再生芽能力受基因型影响。所以，在选择外植体材料来源时，必须首先考虑供试材料的基因型背景。

2 叶片发育程度和再生代数对果树叶片离体培养的影响

叶龄或者继代培养时间也是影响叶片再生能力的一个重要因素。于冬梅等在草莓叶片离体培养试验中发现：M14叶龄为21～28 d的叶盘再生芽频率最高，高达90%。叶龄在30 d以上，不定芽再生率普遍降低，仅为36%。用苹果试管苗叶片为试材一般是选取继代培养20～40 d的新梢叶片。如“皇家嘎拉”继代培养21 d的叶片再生效果最好。在马哈利樱桃试管苗叶片离体培养试验中，短于20 d的嫩叶培养初期均出现水浸状态并且很容易出现死亡；50 d叶龄的叶片，在接种初期又极易出现褐化现象，再生频率明显降低。在枇杷叶片愈伤组织诱导的报道中根据叶龄将叶片分为三个等级：成熟叶(展叶后30 d左右，墨绿色)、中度成熟叶(展叶后10 d左右，绿色)、嫩叶(新展开叶，嫩绿色)。结果表明：枇杷叶片离体再生能力与叶片成熟度密切相关，过嫩或者过老的叶片均不适合用于诱导愈伤组织，展叶10 d左右的中度成熟叶是最佳的诱导材料。

3 叶位对果树叶片离体培养的影响

在葡萄叶片离体培养研究中发现：不定芽的再生受叶位影响非常明显，再生率随叶序位置的下降而降低，数据显示：叶位最上的第1片叶不定芽再生率最高，为33%；第2片则为23%；第3片叶片则降低为15%，而中部叶片及以下均没有不定芽产生。对苹果的研究也发现：愈伤组织的脱分化和再分化能力均与叶位有关。无论是苹果幼苗还是成苗，均是上位叶再分化率较高，高达80%，下位叶较低，为60%。

4 叶片不同部位对果树叶片离体培养的影响

在苹果“皇家嘎拉”的叶片培养试验中发现：在同一叶片上，叶中部比顶部或叶基部的叶段更易于再生植株。在梨的研究中也发现，“八月红”不定芽产生于叶中部的中脉伤口及叶茎部伤口上较多，叶尖部则产生很少。这说明：叶片再生能力受所取叶片不同部位的影响也很大。可能是因为从叶尖到叶基部，叶脉组织发达程度逐渐增强，运输营养物质和生长激素的能力也增强。

5 叶片切割方式对果树叶片离体培养的影响

外植体受伤程度直接影响褐化，为避免褐化的发生，应尽量减小切割长度并缩短外植体接种前与空气的接触时间。在苹果试管苗叶片进行切伤及不切伤处理试验中发现：切伤与不切伤处理对不定芽的发生有很大影响，从再生力、不定芽数、再生率等方面看，切伤均比不切伤高。同时又做了划伤、切块、纵切和横切处理做对比，发现任何切伤方法相比不切伤处理，不定芽的再生能力都有明显的提高。另有研究报道，微金属粒子的轰击也可以提高再生效果。原因可能有以下两点：一是粒子轰击造成伤口，有利于对培养基中营养及激素的吸收，二是创伤诱导了细胞胚胎发生有关的基因表达。

6 叶片消毒方式对果树叶片离体培养的影响

接种之前一定先要对外植体进行消毒。一般先用软毛刷子轻轻刷去表面的尘土，再将外植体浸入稀释的洗衣粉水中浸泡30m in，再然后用自来水流水冲洗。接种前先用75%的酒精表面消毒20～30 s，再用0.1%～0.2%升汞消毒10m in。Fouad等指出：外植体采用0.5%次氯酸钠表面杀菌15～20min，比用10%Ca(ClO)2或0.2%HgCl2处理芽的成活率高。Hammerschlag等人对5种常用消毒方法做了比较试验，结果显示：污染最轻的组合是外植体先用0.5%的NaClO+0.01%吐温浸泡15～20min，再用100mg/L链霉素浸泡15m in，无菌水冲洗3次。消毒时间过长会对材料产生伤害，影响成活率。酒精消毒虽然效果较好，但易对材料造成伤害，加速褐化的发生。

7 小结

在果树组织培养研究方面，利用叶片做外植体的报道已经很多，研究也越来越深入，但是还有很多果树没有成功的离体培养技术，比如三倍体枇杷的叶片再生体系的建立至今尚未见成功报道。本文系统概述了外植体影响组织培养的六大关键因素，希望能对以后果树组织培养的研究有一定的帮助。

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053000 衡水学院生命科学学院 崔文宁