一株白僵菌的分离鉴定及对黄胸散白蚁的室内毒力测定

罗 兰，李 娟，孙骊珠，袁忠林

（青岛农业大学农学与植物保护学院，山东省植物病虫害综合防控重点实验室，山东青岛 266109）

一株白僵菌的分离鉴定及对黄胸散白蚁的室内毒力测定

罗 兰，李 娟，孙骊珠，袁忠林*

（青岛农业大学农学与植物保护学院，山东省植物病虫害综合防控重点实验室，山东青岛 266109）

从罹病的玉米螟（Ostrinia furnacalis G）中分离纯化获得一株新菌株，命名为Bb-1。通过对该菌株的培养性状、形态特征观察，以及ITS基因序列分析，鉴定出Bb-1菌株为白僵菌属的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）。用该菌株的5种浓度孢子液对黄胸散白蚁进行毒力试验。结果表明：用浓度为5×107孢子/mL的孢子液处理8 d，黄胸散白蚁的校正死亡率达95.00%。5～8 d的LC50值为2.05×104～9.05×106孢子/mL。在5×103～5×107孢子/mL浓度下，菌株的LT50值为4.28～8.59 d。

白僵菌；Bb-1；黄胸散白蚁；鉴定；毒力

白蚁是一类多形态、群居性昆虫，以各类纤维素为食，危害农、林、水利、交通、房屋建筑等，给人们带来巨大损失，被国际昆虫生理生态研究中心列为世界五大害虫之一［1-4］。为了减少白蚁的危害，采用化学药剂对其种群进行控制仍是当前主要措施，虽然一些高毒、高残留药剂已被替代，但化学杀虫剂对生态环境和人类健康带来的问题不容忽视［5-7］。因此，寻找安全的替代防治措施显得尤为迫切。

昆虫病原微生物具有选择性好、防效高的特点，且对环境友好，对人畜安全，因此，越来越多的病原微生物被开发用于害虫防治。白僵菌是世界各国研究应用较多的一类昆虫病原真菌，可侵染15目149科700多种昆虫［8］。大量的研究试验证实，白僵菌可对桃蚜、烟蚜、松毛虫、玉米螟、木毒蛾、小菜蛾、西花蓟马等多种害虫有很强的致病性［9-11］。本文对从玉米螟（Ostrinia furnacalis G）上分离获得的白僵菌进行了鉴定，并测定了其对黄胸散白蚁的毒力，为进一步研究和利用白僵菌防治黄胸散白蚁奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

收集自然感染虫生菌的玉米螟幼虫。培养基有马铃薯（PDA）、沙氏（SDAY）和察氏（Czapek）培养基。分离培养基为SDAY。PDA培养基：200 g马铃薯煮汁过滤至1 000 mL，加20 g葡萄糖、20 g琼脂；SDAY培养基：1 000 mL含4%葡萄糖、1%蛋白胨、2%琼脂；Czapek培养基：1 000 mL含3 g硝酸钠、1 g磷酸氢二钾、0.5 g氯化钾、0.5 g硫酸镁、0.01 g硫酸亚铁、30 g蔗糖、20 g琼脂。

1.1.2 供试昆虫

供试白蚁为黄胸散白蚁（Reticulitermes flaviceps），2014年8月20日采集于福建省南平市延平区，用松木在人工气候箱内饲养（温度为25℃、湿度为80%），试虫均为成熟健壮工蚁。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离与纯化

参照严智燕等［12］的方法分离虫生真菌。无菌条件下，用镊子将全身覆盖白色粉状物的玉米螟幼虫夹到已灭菌的SDAY培养基平板上方轻轻地、快速抖动一下，置于26℃恒温培养箱中培养2～3 d，挑取单菌落到纯化培养基上，置26℃下进行纯化培养。

1.2.2 菌株的鉴定

采用插片法对分离纯化的菌株进行形态观察［13］。将灭菌盖玻片以45°斜插在有待观察菌培养基中，26℃培养3～5 d后，取出盖玻片，在显微镜下观察其孢子梗、孢子的形态与大小。

用直径为6 mm的打孔器制作菌饼，分别接种到PDA、SDAY和Czapek培养基上，每种培养基设3次重复，26℃恒温培养，第4，8，13，16天测定其菌落直径及产孢情况，第16天测定其产孢量。菌落直径采用十字交叉法测定。用直径为6 mm的打孔器在菌落中央到边缘的中点处取菌落块，移入三角烧瓶中，加入含有0.2%Tween-80的无菌水，振荡15 min，使孢子均匀分散，配制成孢子悬浮液，用血球计数板测定孢子数量。

将纯化的菌株交上海生工生物工程股份有限公司进行分子测序。特异引物为：ITS1（5'-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3'）、ITS4（5'-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3'）。

详细方法参照文献［14］进行。

1.2.3 菌株对白蚁的活性测定

将菌株接种到PDA培养基上，25℃恒温培养10 d，然后用0.02%Tween-80无菌水配成孢子液，用血球计数板测定孢子浓度，然后配成5×107，5×106，5×105，5×104，5×103，5×102孢子/mL6种浓度菌液。

在6孔培养板上测定菌株对白蚁的活性［15］。将直径为3.5 cm的滤纸放在孔中，取100 μL不同孢子浓度的菌液点滴到滤纸上，空白对照为0.02%Tween-80，每孔20头工蚁，每个浓度重复3次。在（26±1）℃黑暗环境中饲养，连续观察8 d，每天取出死亡个体，并详细记录各浓度组及对照组的累计死亡率。始终保持实验培养皿中较湿润的环境，空白对照的试虫死亡率控制20%以内［16］。

死亡率及校正死亡率按下列公式计算。

数据采用Excel 2007处理，以浓度和时间取对数作为x，校正死亡率换算成几率值作为y，进行直线回归［17］。求得毒力方程，并计算LC50值、LT50值及相关参数。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与鉴定

采用抖动法从自然感染的虫体上分离得到了菌株Bb-1。菌株Bb-1在SDAY培养基上的菌落呈平绒状圆形，颜色由白色逐渐变为乳白或淡黄色，菌丝蓬松，粉层疏松（图1）。

采用插片法，在显微镜下观察其孢子梗、孢子的形态及大小。其孢子梗呈瓶状延伸形成“之”字形，孢子梗多数呈几束聚集一起，分生孢子多为球形，外部光滑，颜色透明且垂直着生于菌丝分支或短的小分支上，分生孢子大小为1～15 μm（图2），初步鉴定为白僵菌。

图2 菌株Bb-1的孢子梗及孢子

从PDA培养基取白僵菌Bb-1的菌丝及孢子进行DNA提取，PCR扩增和序列比对来鉴定白僵菌Bb-1。测序结果与NCBI基因数据库比对表明：经特异引物扩增获得的白僵菌Bb-1核糖体DNA-ITS的长度为549 bp；登录NCBI数据库检索时可见与库内多株球孢白僵菌菌株核糖体DNA-ITS序列同源性最高达到99%。通过鉴定得到的DNA序列为：GTAGGG GTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTT CAACTCCCTAACCCTTCTGTGAACCTACCTATC GTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACG CGGACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTC AAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCTGAATACG CCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTT CAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATG AAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTG AATTGCAGAATCCAGTGAATCATCGAATCTTT GAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCG GGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTC GACCTCCCCTTGGGGAGGTCGGCGTTGGGGAC CGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGT GGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTA ATACAGCTCGCACCGGGACCCCGACGCGGCCA CGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTTGAC CTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTA AG。

通过对ITS区域PCR扩增和测序及同源性比对，从分子遗传信息上最终明确为球孢白僵菌（Beauveria bassiana）。

2.2 菌株的生物学特性

菌株Bb-1在PDA、SDAY、Czapek固体培养基的生长情况详见表1。菌株Bb-1在3种培养基上均能良好生长，但有差异。其在PDA培养基上生长较快，菌落呈平绒状，颜色由白色逐渐变为淡黄，2 d后产孢；其次是SDAY培养基，菌落由白色逐渐变为乳白或淡黄，3 d后产孢；在Czapek培养基上生长最慢，菌落散乱，呈雪花状，极不规则，颜色由白色逐渐变成淡黄或透明，4 d后产孢。第16天产孢量的顺序为：PDA＞SDAY＞Czapek。

表1 菌株Bb-1在不同培养基上的生长状况

2.3 菌株对黄胸散白蚁的毒力

用菌株Bb-1不同浓度的孢子液对黄胸散白蚁进行活性测定，结果见表2。毒力测定的结果表明：随着菌株Bb-1分生孢子浓度的逐渐升高，黄胸散白蚁的校正死亡率也随之增大。当孢子浓度为5×107孢子/mL时，第8天校正死亡率为95.00%；浓度为5×103孢子/mL时，第2天黄胸散白蚁出现死亡，随着时间推移和浓度增加，校正死亡率呈逐渐增加趋势。第5～8天，菌株Bb-1对黄胸散白蚁的LC50值依次为9.05×106，7.72×105，1.17×105，2.05×104孢子/mL；LC95值依次为1.12×1012，8.30×1010，1.95×109，3.92× 107孢子/mL（见表3）。

由表4可知，随着孢子浓度的增加，LT50值逐渐减小，在5×103～5×107孢子/mL浓度下的LT50值分别为8.59，6.68，5.87，5.13，4.28 d。

3 结论与讨论

本研究从自然染病的玉米螟幼虫上分离纯化出1株虫生真菌，鉴定为白僵菌属（Beauveria）的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）。用其不同的孢子浓度测定对黄胸散白蚁的活性，最高浓度8 d的校正死亡率达到95.00%，致死中时间LT50值为4.28 d， 8 d的致死中浓度LC50值为2.05×104孢子/mL。白僵菌对黄胸散白蚁具有较强的生物活性，与陈红梅［18］的研究结果一致，说明白僵菌可以用于白蚁的生物防治。

表2 菌株Bb-1对黄胸散白蚁的毒力测定结果

表3 菌株Bb-1对黄胸散白蚁的致死中浓度

表4 菌株Bb-1对黄胸散白蚁的致死中时间

白僵菌是真菌杀虫应用较为广泛的一个类群，具有诱人的前景，在害虫的综合防治中具有重要的作用。在我国，白僵菌主要用于防治松毛虫、玉米螟和蛴螬等，利用球孢白僵菌防治白蚁的相关文献在国内外还鲜有报道［15］。本研究分离的球孢白僵菌对黄胸散白蚁表现出较强的毒力，具有较好的应用潜力，但田间环境比室内环境复杂得多，其推广应用还有待于进一步深入研究。该菌株对其他白蚁的毒力也有待进一步验证。

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Isolation and Identification of a Strain of Beauveria and Its Virulence to Reticulitermes flaviceps

LUO Lan，LI Juan，SUN Li-zhu，YUAN Zhong-lin*
（Key Lab of Integrated Crop Pest Management of Shandong Province，College of Agronomy and Plant Protection，Qingdao Agricultural University，Shandong Qingdao 266109）

A new strain of Beauveria bassiana designated No. Bb-1 was isolated and purified from the diseased larvae of Ostrinia furnacalis G. The strain was identified bases on its culture traits，morphological characteristics，and ITS sequence analysis. The results showed that the strain belonged to Beauveria bassiana. In virulence test，the corrected mortality rate reached 95.00%under the concentration of 5×107spores/mL. The values of LC50were 2.05×104-9.05×106spores/mL. Under different concentrations，the LT50values were 4.28-8.59 d.

Beauveria bassiana；Bb-1；Reticulitermes flaviceps；identification；virulence

TQ 450.2+1

A

10.3969/j.issn.1671-5284.2016.02.005

2015-12-23

国家自然科学基金项目（31272106）；山东省“泰山学者”建设工程专项

罗兰（1965—），女，陕西省咸阳市人，教授，博士，主要从事农药的教学与研究。Tel：0532-88030495；E-mail：luolanchinese@163.com

袁忠林（1964—），男，陕西省扶风县人，教授，博士。E-mail：zhongliny@163.com

顾林玲）

◆研究与开发◆