高温胁迫对高温筛选后海带配子体存活率和生理的影响

彭 捷 ，崔翠菊 ，张立楠 ，曲艳艳 ，李晓捷，姜 炜，刘延岭 ，李 言，田萍萍

( 1.山东东方海洋科技股份有限公司 国家海藻与海参工程技术研究中心， 山东 烟台 264003；2.青岛农业大学 海洋科学与工程学院，山东 青岛 266109； 3.烟台市海洋环境监测预报中心，山东 烟台 264003 )

高温胁迫对高温筛选后海带配子体存活率和生理的影响

彭 捷1，崔翠菊1，张立楠2，曲艳艳1，李晓捷1，姜 炜3，刘延岭1，李 言1，田萍萍1

( 1.山东东方海洋科技股份有限公司 国家海藻与海参工程技术研究中心， 山东 烟台 264003；2.青岛农业大学 海洋科学与工程学院，山东 青岛 266109； 3.烟台市海洋环境监测预报中心，山东 烟台 264003 )

试验以经过高温筛选存活的海带配子体奔牛(Bn-23-b-2 d，Bn-23-b-8 d)和对照组配子体奔牛(Bn)为试验材料，在23 ℃分别处理4、8 d和12 d，进行了耐高温能力的验证。试验结果表明，3种材料的存活率随处理时间的延长均呈下降趋势，且3种材料的耐高温能力与之前的试验结果一致，依次为Bn-23-b-8 d> Bn-23-b-2 d>对照组Bn。同时，在高温处理的不同时间点(4、8、12、16 d)，对3种配子体的叶绿素a、脯氨酸、丙二醛及可溶性糖含量进行了检测，其中，对照组配子体叶绿素a含量随处理时间延长一直下降，而Bn-23-b-2 d与Bn-23-b-8 d有一定上升后下降；脯氨酸含量在高温胁迫下迅速积累，其中Bn-23-b-8d前期抵抗高温能力最强，抗高温时间最长；对照组Bn丙二醛和可溶性糖含量变化最明显，受到的高温胁迫强度最大。这4种生理指标的变化可以反映配子体的耐高温能力，与存活率验证得到的结果相符。该研究结果显示，高温筛选后其存活率和生理指标的变化能够反映其耐高温能力，为后期耐高温品种的选育奠定了基础。

高温胁迫；高温筛选；海带配子体；存活率；生理

自20世纪50年代夏季育苗法的创立以来，由于海带(Saccharinajaponica)具有极高的经济和生态价值，海带养殖业迅速发展并一跃成为中国最大的海水养殖产业，栽培区域主要分布在北方的辽宁、山东以及南方的江苏、浙江和福建。海带人工育苗是发展我国海带养殖事业的一个重要环节，目前随着海洋污染和温室效应的影响，海带育种中存在的突出问题是海带耐高温能力弱，在人工培育海带幼苗过程中经常出现烂苗、掉苗以及畸形等现象[1-4]。因此，通过研究海带耐高温的生理机制来提高海带的耐高温能力，培育和筛选耐高温的海带新品种，对于发展我国海带养殖事业具有重要意义。海带的生活史属于典型的异型世代交替，由二倍体孢子体世代和单倍体配子体世代组成。海带配子体具有遗传性一致、发育全能性和可长期保存的特点，在一定条件下可形成无性繁殖系，在此基础上研究者成功实现了利用海带单克隆无性繁殖系育苗的新方法[5-8]。将进行营养生长的雌、雄混合的克隆适度切碎后，将其按一定比例混合均匀后喷洒在附苗器上，经过附着、培养后获得海带幼苗，期间定期镜检、换水。此育苗方法前期克隆在实验室集约培养，附苗时间不受限制，避免了孢子体采苗的混合繁殖过程，能够长期保持品种的优良性状。此外，它减少了传统育苗生产需海上栽培和选择种海带环节，相应地缩短了育苗时间，同时节省了育苗成本，其最大优势是为海带杂种优势利用奠定了基础[6,8-10]。近几年通过配子体克隆杂交得到的常规品种(如901)和杂交品种(如东方2号和东方3号)均高产且耐高温能力得到加强，但耐高温品种的选育存在一定的盲目性。因此，耐高温海带配子体的筛选与应用对于开发耐高温的杂交海带亟不可待[11-13]。Zhang等[14]比较了在不同温度下处理不同天数的海带游孢子与幼配子体生长状况，指出初始培养阶段的高温处理及处理时间长短明显影响了海带游孢子与幼配子体的生长发育，游孢子比幼配子体对高温更敏感。宣慧等[15]研究了不同温度处理下海带配子体的生长状态及生理指标的变化趋势，指出海带配子体最适宜的生长温度是20 ℃以下，高于20 ℃海带配子体已经处于胁迫状态，25 ℃时已经不能耐受。王悠等[16]对海带在高温胁迫下响应机理进行了初步研究，指出高温使海带的生长受到抑制,对褐藻酸降解菌的抗性降低，并推测高温对细胞膜的伤害作用是引起海带生长抑制、抗性降低并造成病烂的原因。除此以外，有关高温对海带配子体生长变化研究很少。本研究将实验室Zhang等[14]筛选得到的海带耐高温配子体(Bn-23-b-2 d，Bn-23-b-8 d)进行耐高温能力验证，对3种材料高温胁迫不同时间点叶绿素a、脯氨酸、丙二醛及可溶性糖含量进行了检测，揭示耐高温海带配子体随处理时间延长生理指标的变化，为研究其高温机制提供理论依据。同时，通过比较高温处理后配子体存活率的变化来检验其耐高温能力，为后期耐高温品种的选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为本实验室经过高温筛选的海带奔牛雄配子体Bn-23-b-2 d♂(游孢子阶段高温处理2 d的材料)、Bn-23-b-8 d♂(游孢子阶段高温处理8 d的材料)、正常条件生长的Bn配子体♂作为对照组。培养条件为：温度10 ℃；光照度1500 lx；光时24 h/d。每星期更换一次培养液。

1.2 配子体存活率的测定

将3种材料进行打碎处理，方法是使用超声破碎仪将海带配子体400 W处理30 s后再用200 W处理60 s，160倍显微镜下观察视野中约15个细胞段(2～5个细胞)，量筒量取30 mL含有上述细胞段的培养液倒入直径9 cm的培养皿。每种材料选取3个克隆系，打碎后放入10 ℃正常条件下过渡培养 3 d，再放入23 ℃中分别处理4、8、12 d，对照皿(0 d处理)一直放在10 ℃正常环境中培养。每个培养皿上分别选取3处做标记。高温处理之前对显微镜下这3个固定视野进行计数，取其平均值记为An；高温处理之后对该固定视野计数，取其平均值记为Cn，存活率(%)=Cn/An。最终分别统计3种材料成活率。

1.3 生理指标的测定

对3种材料进行23 ℃处理，分别在处理4、8、12、16 d时测定各项生理指标，每个处理组合设置3个平行试验。叶绿素a的含量采用乙醇法测定[17]；脯氨酸的含量采用酸性茚三酮比色法测定[17]；丙二醛的含量采用硫代巴比妥酸比色法测定[17]；可溶性糖的含量采用蒽酮—硫酸比色法测定[18]。

2 结果与分析

2.1 存活率的比较

通过在高温处理下存活率的变化来反映3种配子体耐高温的能力。随着处理时间的延长，3种海带配子体存活率均依次下降(图1)。处理4 d时，下降极其明显，存活率约40%，由于打碎处理对配子体伤害较大，需要自身调节适应；4 d后虽然均继续呈下降趋势，但3种材料的下降幅度有所区别，其中Bn-23-b-8 d下降较慢，对照组Bn下降明显；处理8 d时，三者存活率为Bn-23-b-8 d>Bn-23-b-2 d>对照组Bn，可见，耐高温能力依次为Bn-23-b-8 d>Bn-23-b-2 d>对照组Bn。数据分析得到Bn-23-b-8 d与对照组差异显著，说明游孢子阶段高温处理8 d的材料耐高温能力最强；处理12 d时，Bn-23-b-2 d与对照组存活率相当，均不足20%，而Bn-23-b-8 d与对照组依然差异显著，可见Bn-23-b-8 d耐高温能力远远大于Bn-23-b-2 d，原因是Bn-23-b-2 d早期处理时间较短，对高温适应能力不强，抵抗高温能力较弱。

图1 3种配子体在23 ℃条件下存活率的变化

2.2 高温胁迫下叶绿素a含量的变化

3种配子体的叶绿素a初始值不同(图2)，分析是克隆本身原因所致。处理4 d时，对照组Bn和Bn-23-b-2 d叶绿素a含量基本不变，Bn-23-b-8 d稍有提高，原因是3种配子体均处在对高温处理的适应期。4 d后，3种材料叶绿素a含量出现不同变化。对照组Bn含量明显下降，且一直呈下降趋势。表明其对高温没有抵抗能力，叶绿素a逐渐分解。Bn-23-b-8 d含量逐渐上升，12 d时测量达到峰值，之后有所下降。Bn-23-b-2 d含量也逐渐上升，但在高温处理8 d时达到最高值，之后随着处理天数的增加呈下降趋势。与8 d 材料相比，2 d材料耐高温能力较弱，因此叶绿素a含量达到的峰值时间早于8 d材料，之后便呈下降趋势。结果表明,3种供试材料对高温的抵抗能力为Bn-23-b-8 d>Bn-23-b-2 d>对照组Bn。

2.3 高温胁迫下脯氨酸含量的变化

3种配子体的脯氨酸含量初始值不同(图3)，分析原因是克隆本身所致。随着处理时间的延长，3种材料的脯氨酸含量都有所上升，脯氨酸在高温胁迫下迅速积累，以维持体内渗透平衡，加强自我保护。在处理8 d时Bn-23-b-2 d与对照组Bn都达到峰值，且有所差异。12 d时，Bn-23-b-8 d达到最大值，明显高于其他两种材料，差异很显著。结果与之前研究吻合，前人研究得到许多耐热的植物品种比不耐热品种在高温胁迫时脯氨酸积累多[19-20]。12 d后，3种材料的脯氨酸含量都有所下降 ，表明随着处理时间延长，高温对配子体的伤害太大，超出脯氨酸的抵抗能力，蛋白质合成受阻。由图3脯氨酸的变化趋势得到， Bn-23-b-8 d的耐高温能力相对较高，虽然后期细胞受高温胁迫有所影响，但前期抵抗高温能力最强，抗高温时间最长。Bn-23-b-2 d稍强于对照组Bn，差异并不明显，分析是Bn-23-b-2 d在游孢子阶段只高温处理2 d，与对照组Bn耐高温能力没有明显差异。

图2 3种配子体在23 ℃条件下叶绿素a含量的变化

图3 3种配子体在23 ℃条件下脯氨酸含量的变化

2.4 高温胁迫下丙二醛含量的变化

植物可通过丙二醛含量的多少反映细胞膜被破坏的程度，丙二醛是细胞膜脂过氧化的重要产物。高温胁迫会对细胞造成氧化伤害并产生大量的氧自由基，从而产生丙二醛[21]。3种配子体的丙二醛含量初始值不同(图4)，分析是材料本身原因所致。处理初始阶段，Bn-23-b-8 d与Bn-23-b-2 d变化不明显，可能是植物保护酶产生一种防御反应，它对体内的活性氧和自由基有一定的清除能力，而对照组Bn的植物保护系统较弱，因此丙二醛含量快速上升。随着时间延长，细胞膜受到一定程度破坏，丙二醛含量也越来越高，由图4可以看出，丙二醛含量上升趋势是对照组Bn>Bn-23-b-2 d>Bn-23-b-8 d。Bn-23-b-8 d到处理12 d时达到峰值后又下降，可能已经对高温胁迫产生了一定的适应性，这与王仕林等对油菜幼苗的研究结论相似[22]。到16 d时，对照组Bn与Bn-23-b-2 d含量均达最大值，远远高于初始值，说明高温对膜脂造成了不可逆的严重伤害。此结果表明Bn-23-b-8 d的抗高温能力强于Bn-23-b-2 d与对照组Bn。

图4 3种配子体在23 ℃条件下丙二醛含量的变化

2.5 高温胁迫下可溶性糖含量的变化

植物为了响应外界胁迫，会主动积累一些可溶性糖，以适应周围环境的变化。3种配子体的可溶性糖含量初始值不同(图5)，分析是材料本身原因所致。高温处理前期，Bn-23-b-8 d与Bn-23-b-2 d可溶性糖含量略微下降或保持不变，而对照组Bn在处理4 d时达到峰值，表明对照组Bn受温度影响较大。随着胁迫时间增加，Bn-23-b-8 d与Bn-23-b-2 d含量逐渐上升，12 d达到最大值后下降，而对照组Bn含量保持下降趋势。从整体变化趋势可看出，随着高温处理时间的延长，游孢子阶段经过高温处理的海带配子体材料较对照组材料变化更稳定，表明其对高温胁迫的响应可能更小。

图5 3种配子体在23 ℃条件下可溶性糖含量的变化

3 讨 论

温度是影响海带生长及生理生化特性的重要因素之一。从以上对存活率的验证试验和四项与逆境相关指标的检测结果看出，游孢子阶段高温处理不同时间的海带配子体对高温的抵抗能力是有差异的，在一定范围内，游孢子阶段处理时间较长的配子体耐高温能力较强，因此，试验中3种材料的耐高温能力依次为Bn-23-b-8 d> Bn-23-b-2 d>对照组Bn。

3.1 高温胁迫对耐高温海带配子体存活率的影响

对于存活率的检测，并无相关报道，存活率的检测对于耐高温海带配子体的耐高温能力的评估最直观了当，简单易行。经多次试验发现，在高温处理后海带配子体存活率的变化在不同品种的配子体材料中会有所区别，同时与胁迫时间也有一定关系；试验中要特别注意外界杂菌的污染，操作中要尽量避免杂菌侵入，其对存活率有很大的影响，要定期换水、镜检，保证结果的可靠性。

3.2 高温胁迫对耐高温海带配子体生理指标的影响

高温胁迫影响了海带叶绿素的含量，胁迫初期，3种配子体的叶绿素含量都基本不变或有所上升，说明藻体受高温胁迫时会产生应激反应，高温诱导藻体维持正常的细胞渗透浓度和功能蛋白的数量，使细胞处于正常代谢状态，从而起到自我保护的作用[23]。之后叶绿素含量逐渐下降，可能是藻体的细胞结构遭到破坏，一方面降低了叶绿素的合成速率，另一方面引起了活性氧的积累从而加速了叶绿素的降解，因此导致叶绿素含量下降[24]。脯氨酸以游离状态广泛地存在于植物体中，它是植物蛋白质的组分之一，多项研究表明在胁迫条件下植物通过积累脯氨酸可以提高抗胁迫能力[25]。本试验检测的脯氨酸含量在3种材料中前期均有所上升，Bn-23-b-8 d材料抗高温能力较强，抗高温时间最长，而12 d后三者都逐渐下降，没有明显区别，可能是脯氨酸与植物抗逆性的关系并不简单, 因为在逆境胁迫下, 植物存在各种抗逆途径, 不同植物不同条件下可能会通过不同途径抵抗外界不良环境[25]。高温条件会增加植物体内的丙二醛含量，试验中高温胁迫时间的延长，使得供试材料的丙二醛含量有所上升，检测时间结束时不同材料结果有所区别，可看出其对高温适应的能力差异。可溶性糖在一定程度上可以反映植物所受逆境胁迫的程度，同时作为一种渗透调节物质，它在高温胁迫的初期会积累以保持细胞膜结构的稳定性，随着胁迫时间的延长，植物通过糖的分解为基本的代谢提供能量，使得生物体维持正常生存。可溶性糖含量逐渐减少，说明其不仅受外界环境的影响，同时也参与了植物本身的生长代谢[26]。

3.3 海带配子体的材料选择及研究方法改进

在胁迫时间点方面, 本试验还存在一定的局限性, 未来的研究可以将处理时间延长后继续检测各指标含量的变化规律，也可以测定更短的时间间隔内的变化特征。本试验所采用的奔牛雄配子体，据文献报道，海带雄配子体在高温环境下存活的能力明显强于雌配子体[27]。Zhang[14]等研究中也有此发现[14]。本研究所采用的是奔牛的雄配子体，不同品种、不同性别的海带配子体对温度的响应可能会有所区别，不同生理指标的变化也会有所差异，因此在对海带配子体的高温胁迫研究上应区别对待，要针对配子体材料的不同特点开展选育工作，以期得到更适宜的耐高温品种。

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EffectsofHighTemperatureStressonSurvivalandPhysiologyofKelpLaminariajaponicaGametophytesScreenedbyHighTemperature

PENG Jie1, CUI Cuiju1, ZHANG Linan2,QU Yanyan1,LI Xiaojie1,JIANG Wei3,LIU Yanling1, LI Yan1, TIAN Pingping1

( 1. National Algae and Sea Cucumber Engineering and Technique Research Center, Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd, Yantai 264003, China; 2. Marine Science and Engineering College, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 3. Monitoring and Forecasting Center of Ocean Environment of Yantai, Yantai 264003, China )

In this experiment, the gametophytes (Bn-23-b-2 d, Bn-23-b-8 d) screened by high temperature stress and Bn in control groups were used to verify the resistant ability to high temperature under 23 ℃ for 4d, 8d and 12 d. The results showed that the gametophytes of Bn-23-b-2 d, Bn-23-b-8 d, and Bn had decrease in the survival rate with the elapse, with the order as Bn-23-b-8d> Bn-23-b-2 d>Bn. Meanwhile, the physiological indicators including the contents of chlorophyll-a, proline(Pro), malondialdehyde (MDA) and soluble sugar were determined in the gametophytes of Bn-23-b-2 d, Bn-23-b-8 d, and Bn exposed to 23 ℃ for 4 d, 8 d, 12 d and 16 d, respectively. It was found that the chlorophyll-acontent was declined in the Bn with the extension of time, but increased initially and then dropped down in Bn-23-b-2 d and Bn-23-b-8 d. The Bn-23-b-2 d and Bn-23-b-8 d had rapidly accumulated Pro content under high temperature, the maximal resistance capability to high temperature in the Bn-23-b-8 d. The most obvious changes in MDA and soluble sugar contents were observed in the control group Bn. The high temperature tolerance capability of gametophyte was reflected in variations in physiological indicators, which was consistent with the survival. The findings reflect the high temperature resistant ability of the kelp gametophytes screened by high temperature, and provide the foundation with breeding of high temperature resistant varieties.

high temperature stress; high temperature screening;Laminariajaponicagametophyte; survival rate; physiology

S968.421

A

1003-1111(2016)01-0032-05

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.01.006

2015-04-29；

2015-07-20.

国家科技支撑计划项目(2012BAD55G01)；国家高技术研究发展计划(“863”计划)项目(2012AA10A406);烟台市科技发展计划项目(2013LGS002).

彭捷(1982-)，女，工程师，硕士;研究方向：海藻遗传育种.E-mail：pengjie333@163.com.