膜荚黄芪多糖外源因素诱导组合的筛选1)

刘振鹏 徐姣 张开雪 闫嵩 任伟超 马伟 刘秀波

(黑龙江中医药大学，哈尔滨，150040)



膜荚黄芪多糖外源因素诱导组合的筛选1)

刘振鹏 徐姣 张开雪 闫嵩 任伟超 马伟 刘秀波

(黑龙江中医药大学，哈尔滨，150040)

利用正交试验设计，以膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.))生物活性物质——黄芪多糖质量分数为衡量指标，筛选出最佳外界诱导因素组合。结果表明：影响叶、茎多糖质量分数的最佳处理时间是9 d和6 d；影响根多糖质量分数的最佳处理时间是6 d。影响叶多糖质量分数的最佳处理组合是培养基处理地下部位9 d，影响茎多糖质量分数的最佳处理组合是硝酸银处理地下部位9 d，影响根多糖质量分数的最佳处理组合是培养基处理地上部位6 d。黄芪多糖代谢途径的最佳外源诱导因素是硝酸银溶液，最佳处理部位是地下部分，最佳处理时间是6～9 d，最佳多糖质量分数变化检测部位是黄芪根部。

外源诱导；黄芪多糖；生物活性物质；正交试验

We studied the content ofAstragaluspolysaccharides inAstragalusbioactivator induced by external stimuli and screening out the best combination of stimulating factors. By using the orthogonal experiment design, the content ofAstragaluspolysaccharide was measured for measurable indicator, screening for regulation elicitor ofAstragaluspolysaccharide for secondary metabolism pathways. The best treatment times for leaves and stems were 9 and 6 d, respectively, and the best treatment time for roots was 6 d. The best combination of the treatment for leaf polysaccharide was A2B4C2; the best combination of the treatment for stem polysaccharide was A4B4C2; the best combination of the treatment for root polysaccharide was A2B3C1. The silver nitrate solution was the best elicitor of polysaccharide secondary metabolic pathways, the best processing part was the underground part, the best time for treatment was 6-9 d, and the best detection part was root.

黄芪作为一种重要的中药，在古代常被用于益气固表，补气养血，降血压。在现代药理学中人们发现：黄芪多糖(APS)对免疫系统、心血管系统、造血系统、物质代谢系统，以及保肝、护肾、抗病毒、抗肿瘤等方面具有广泛影响[1-3]。通过现代医学技术，人们发现在黄芪中的主要药效学物质为次生代谢产物多糖类、黄酮类和皂苷类[4]。在长期进化中，植物响应环境刺激，以初生代谢产物为底物，衍生出许多次生产物[5]。本研究根据外界刺激因素对黄芪多糖质量分数的诱导结果，筛选出最佳诱导因素组合，为多糖代谢途径的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑龙江中医药大学马伟研究员课题组提供膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.)种子。该种子在日光温室内进行无土栽培，出苗培养35 d，长出7片真叶，幼苗高约15 cm。全株采样，在105 ℃、0.5 h烘干杀青，然后再用80 ℃烘干至相对恒定质量，以1 600 r·min-1速度球磨机对样品研磨20 min，粉末用于成分提取。利用722型分光光度计检测黄芪生物活性物质黄芪多糖质量分数。

1.2 研究方法

1.2.1 正交追加试验设计

利用SPASS软件进行L24(6×4×23)不等水平正交追加试验设计与Microsoft Excel软件进行数据分析。试验分三因素不等水平：A(刺激因素)包括7水平，分别为水，培养基溶液(OD600=0.007)，0.1% tween溶液，AgNO3、MeJA、SA溶液(30 μmmol·L-1)，内生菌发酵液(OD600=0.023)；B(诱导时间/d)分为0、3、6、9、12 d，共5个水平；C(处理部位)分为地上部分、地下部分2水平。处理后对各试验处理的黄芪植株根、茎、叶的多糖质量分数进行测定。

1.2.2 多糖质量分数测定

多糖提取：5 g样品，20倍体积的70%乙醇室温浸提10 h，超声提取0.5 h，12 000 r·min-1离心20 min，分离后，将药渣用20倍体积水80 ℃水浴提取2 h，离心20 min，丢弃药渣，将提取液在4倍体积乙醇4 ℃下，冷藏1 h，离心20 min，将沉淀用适量体积的水溶解，离心5 min，取上清液，此时即为多糖溶液[6-7]。

对照品溶液的制备：精密称取对照品葡萄糖1 mg，置于10 mL容量瓶中，加水溶解，并定容到刻度，摇匀即得[6-7]。

标准曲线的制备：用移液器精密量取对照品溶液0、0.015、0.030、0.045、0.060、0.075 mL，分别置1.5 mL离心管中，分别准确加水至0.075 mL，再分别加入2%蒽酮乙酸乙酯溶液0.075 mL，置冰浴中缓缓加入硫酸溶液0.75 mL，摇匀后置沸水浴中保温1 min，取出后立即冰浴冷却至室温，在630 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标绘制标准曲线，Y=26.976X+0.031 2，R2=0.999 6[6-7]。

样品多糖质量分数的测定：用移液器精密量取样品0.075 mL，按照测定标准曲线的方法操作，显色稳定后，12 000 r·min-1离心5 min后上机测定吸光度值，依据标准曲线计算样品中的黄芪多糖质量分数。

2 结果与分析

2.1 诱导因素对黄芪各生长部位多糖质量分数的影响

2.1.1 极差分析结果

正交试验中各处理组合黄芪多糖质量分数见表1。对表1数据进行极差分析，结果表明，诱导叶多糖质量分数增加的最佳组合是A2B4C2，诱导茎多糖质量分数增加的最佳组合是A4B4C2，诱导根多糖质量分数增加的最佳组合是A2B3C1。各因素的主效作用顺序是B>A>C(表2)。

2.1.2 方差分析结果

由表3可以看出，诱导因子种类、处理时间对黄芪根、茎、叶部位的黄芪多糖质量分数的影响极显著；处理部位对黄芪茎和叶部位多糖质量分数的影响不显著，而对黄芪根多糖质量分数的影响达到了极显著水平，地下部位处理的根多糖质量分数极显著地高于地上部位处理。

2.2 外源刺激因素的多重比较

将各外源刺激因素对黄芪多糖质量分数影响的数据结果做进一步的单因素多重比较，各因素比较结果见表4。培养基溶液处理的叶多糖质量分数显著高于内生菌液、水、水杨酸、茉莉酸甲酯、吐温溶液处理；硝酸银溶液处理的叶多糖质量分数显著高于水杨酸、茉莉酸甲酯、吐温处理，硝酸银、内生菌发酵液(内生菌发酵液一般会刺激次级代谢产物的生成，调控药用植物活性成分的生物合成[8-10])和水溶液处理水平之间叶多糖质量分数差异不显著。诱导子硝酸银溶液处理的茎多糖质量分数显著高于内生菌发酵液、水杨酸、培养基、茉莉酸甲酯溶液处理；水溶液处理的茎多糖质量分数显著高于培养基、茉莉酸甲酯溶液处理；吐温、内生菌发酵液、水杨酸溶液处理的茎多糖质量分数显著高于茉莉酸甲酯溶液处理。培养基、水杨酸、内生菌发酵液、茉莉酸甲酯、硝酸银溶液处理的根多糖质量分数显著高于吐温、水溶液处理，培养基、水杨酸、内生菌发酵液、茉莉酸甲酯、硝酸银溶液处理的根多糖质量分数差异显著；吐温溶液处理的根多糖质量分数显著高于水溶液处理。

表1 L24(6×4×23)不等水平正交追加试验结果

mg·kg-1

表2 诱导因素水平对黄芪多糖质量分数影响的极差分析结果 mg·kg-1

表3 诱导因素水平对黄芪多糖质量分数影响的方差分析结果

注：a为R2=0.631(调整R2=0.606)；b为R2=0.862(调整R2=0.852)；c为R2=0.844(调整R2=0.833)。

表4 A因素各水平多重比较

注：叶中误差项为均方值(错误)=0.789。茎中误差项为均方值(错误)=0.570；根中误差项为均方值(错误)=1.184。表中同列数据后不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

综上，从外源因素对黄芪中多糖质量分数的影响的多重比较结果来看，培养基溶液处理水平可使根和叶部位的多糖质量分数显著提高，而硝酸银溶液处理水平可使茎多糖质量分数显著提高。从整体来看，硝酸银和培养基溶液是较优的处理水平。

2.3 时间因素的多重比较

将各时间因素对黄芪多糖质量分数影响的数据结果做进一步的单因素多重比较，结果见表5。从表5可以看出：时间因素中的6、9 d处理水平对黄芪叶和茎中多糖质量分数的影响显著高于12、3、0 d处理水平下的黄芪叶和茎多糖；12 d的处理水平下的黄芪叶和茎多糖质量分数显著高于3、0 d处理水平；3 d的处理水平下的黄芪叶和茎多糖质量分数显著高于0 d的处理水平，时间处理因素对叶和茎多糖质量分数影响的多重比较结果是一致的。时间因素中的6 d处理水平对黄芪根中多糖质量分数的影响显著高于12、9、3、0 d处理水平；12、9 d的处理水平下的黄芪根多糖质量分数显著高于3、0 d处理水平；3 d的处理水平下的黄芪根多糖质量分数显著高于0 d的处理水平。

表5 B因素各水平多重比较

注：叶中误差项为均方值(错误)=0.789；茎中误差项为均方值(错误)=0.570；根中误差项为均方值(错误)=1.184。表中同列数据后不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

综上，从时间因素对黄芪多糖质量分数影响的多重比较结果来看，影响叶、茎多糖质量分数的最佳处理水平是9 d和6 d；影响根多糖质量分数的最佳处理水平是6 d。从整体来看，时间因素对黄芪多糖质量分数影响的最佳处理水平是6～9 d。

3 结论

从各诱导因素对黄芪多糖质量分数的直观分析和方差分析结果来看，影响叶多糖质量分数的最佳处理组合是A2B4C2，即培养基溶液进行地下部位处理9 d的处理组合；影响茎多糖质量分数的最佳处理组合是A4B4C2，也就是硝酸银溶液进行地下部位处理9 d的处理组合；影响根多糖质量分数的最佳处理组合是A2B3C1，也就是溶液进行地上部位处理6 d的处理组合。

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Content of Bioactivator ofAstragalusBy Exogenous Factors//

Liu Zhenpeng, Xu Jiao, Zhang Kaixue, Yan Song, Ren Weichao, Ma Wei, Liu Xiubo

(Heilongjiang University of Chinese Medicine. Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(11)：78-80，88.

Exogenous stimulus;Astragaluspolysaccharide; Bioactivator; Orthogonal experiment

1)黑龙江省杰出青年基金(JC201101)；国家自然科学基金(81274010)；黑龙江中医药大学“优秀创新人才支持计划”(2012001)；哈尔滨市优秀学科带头人基金(2014RFXXJ122)。

刘振鹏，男，1992年1月生，黑龙江中医药大学药学院，硕士研究生。E-mail：2297527225@qq.com。

刘秀波，黑龙江中医药大学佳木斯学院，副教授。E-mail：358270831@qq.com。

2016年4月12日。

Q946.8；R282

责任编辑：程 红。