现代核磁共振技术教学研究及其在分析检测中的应用

吕玉光　宋　笛　于莉莉　王伟娥　王朝兴

杜梦圆1　杜浩然1　高蕻冰1　 石春卉3

(1.佳木斯大学 药学院，佳木斯 154007；2.佳木斯大学 国际教育学院，佳木斯 154007；3.佳木斯大学 临床医学院，佳木斯 154002)



现代核磁共振技术教学研究及其在分析检测中的应用

吕玉光1宋笛1于莉莉2王伟娥1王朝兴1

杜梦圆1杜浩然1高蕻冰1石春卉3

(1.佳木斯大学 药学院，佳木斯 154007；2.佳木斯大学 国际教育学院，佳木斯 154007；3.佳木斯大学 临床医学院，佳木斯 154002)

核磁共振仪主要面向科研工作者, 因此该仪器的开放对象为经常使用该仪器的本院教师和在读研究生。在教学和科研方面, 目的是提高学生的实践能力和创新能力，使学生成为高素质的应用型、创新型人才；培养一批熟悉仪器设备的性能、工作条件、操作方法的人才，为他们将来步入工作岗位适应社会的发展和需求打下良好的基础。同时也培养一大批具有实际操作技能和管理经验的专门人才，以满足社会对高素质应用型人才的需求。因此，现代核磁共振技术教学和科研研究方面应用非常广泛。

核磁共振技术教学研究分析检测应用研究

核磁共振仪(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)由于可以广泛应用于化学、化工、医药、生物、医学、材料等研究领域的样品测试，受到了高等院校的青睐，随着我国中央和各级地方政府对高等办学经费和科研项目投入的增加，目前国内拥有核磁共振仪器的高等学校和科研院所非常普遍，有的单位还拥有不止一台。但是由于该仪器价格昂贵，操作及维护比较复杂，一般有专人负责管理、维护和使用，一般的本科生、研究生无法实际操作，也没有针对本科生或研究生的实验课程。核磁共振波谱(magnetic resonance spectroscopy, MRS)是利用磁共振成像设备, 获得物质的磁共振波谱信息, 并探测其含量变化的新技术。核磁共振波谱是由化学位移、J-耦合裂分的波形及频率成分按其内在规律排列组合而成的, 可用于测定分子中某些原子的数目、类型和相对位置。

本文结合核磁共振技术近年来取得新成果, 介绍核磁共振波谱在分析检测中的应用。例如，体内药物分析是对生物体内药物及其代谢物的分析。由于体内样品具有药物及其代谢物在大量的体液中浓度很低; 存在着内源性干扰物质; 取样量受限制; 样品不重复性这些特点。而NMR在体内药物分析中有明显的优点, 即简便性、无损伤性、连续性、高分辨性和多目标性, 使其在体内药物分析中有较广泛的应用。近年来NMR谱技术发展到对整体生物系统进行体内药物分布、代谢监测。因此，现代核磁共振技术在分析检测中的具有重要的作用和意义[1-6]。

1　 国内外研究现状分析

自1946年美国斯坦福大学的F. Bloch教授和哈佛大学的EM. Purcell教授领导的两个实验室首次独立地观察到核磁共振(NMR)现象以来, 已有10位科学家因在核磁共振技术领域的卓越贡献而荣获诺贝尔奖, 由此可见这门技术所发挥作用的重要性。核磁共振波谱是利用磁共振成像设备, 获得物质的磁共振波谱信息, 并探测其含量变化的新技术。由化学位移及J-耦合裂分的波形及频率成分按其内在规律排列组合而成的, 它可以由自由感应衰减信号或自旋回波信号转换成振幅与频率的函数而获得。

核磁共振法以其重现性好、特征性强等优点已成为药物研究的重要手段。特别是最近发展起来的扩散排序核磁共振法、二维和三维氢谱、碳谱数学解谱、液相色谱-核磁共振联用技术为研究药物有效成分、分析物质化学结构、创建合理的药物/临床疗效结构模式等方面带来了广阔前景。利用该法还可进行痕量、无损、非分离等在线分析,为有效地研究药物有效成分带来了巨大帮助。由于核磁共振具有指纹图谱特点, 因而近来创建的中成药核磁共振指纹图谱鉴定分析法为中成药的分析鉴别带来了快速、有效、可靠的途径。同时随着天然药物生产领域的发展,核磁共振作为质量控制的手段已得到重视,并逐渐地应用于实践。总之, 核磁共振无疑会给分析检测研究带来巨大的推动作用[7-14]。

2　研究步骤和创新方法

目前国内多数拥有核磁共振仪的单位对有关核磁共振的教学主要以理论教学为主，注重理论知识的讲解，结合演示实验，或以虚拟软件为平台进行模拟实验，学生基本无法上机操作。甚至根本不开设实验课，只讲述理论课，这与国内日益增长的对大型仪器的管理维护人才的需求不相适应。国外的大学一般对研究生开放，研究生经过培训并考核合格后可以独立上机操作。核磁共振理论课内容比较深奥，学生尤其是本科生普遍反映课程枯燥，知识难于掌握，如果在理论课程讲述过程中增加仪器介绍以及开设相应的实验课，比如介绍仪器的起源，简单的工作原理，最新应用技术的进展，并结合直观的上机实验操作，使学生充分了解核磁共振的最新功能和技术，可以大大激发学生的学习热情和动手操作的欲望，对最终达到拓展视野、学以致用、学会创新、掌握技能的教学目的具有很好的促进作用。实验教学是培养学生综合素质和创新能力的不可替代的平台，是巩固理论教学，培养创新人才的重要环节。探讨如何结合核磁共振的新功能和新技术，对实验教学内容进行改革和创新，改变以往实验课依附于理论课，滞后于新知识、新技术发展的实验教学模式，对提高学生的学习兴趣意义重大。实验教学不仅仅是理论联系实际的重要环节，更重要的是其本身就是培养学生自己动手解决实际问题的能力、自我学习能力、培养创新精神和创造能力的重要途径。事实表明，高等学校的实验室是学生提高动手能力，发展创新的重要基地。尤其是大型仪器设备，是高等学校的优质资源，是培养高层次人才、发展高科技的重要工具。因此加强实验教学、重视学生能力的培养已越来越受到各高校的重视。传统的实验教学方式常常束缚了学生的主动性和创造性，不利于培养学生分析和解决问题的能力，更不利于创新精神和实践能力的培养和提高。为培养学生实践能力、创新精神、创新能力和科学素养，核磁共振可以考虑开设原理性和研究性两类实验课程。原理性实验课可以帮助学生建立和巩固核磁共振波谱的基本概念和基本理论，培养科学素养，研究性实验(创新实践课程，学生可独立设计实验方案，以实现预期实验目标)可以锻炼学生的综合技能，为“大学生创新科技计划”、“挑战杯”、“新苗人才计划”提供技术支撑与科研平台。为了既培养学生的实验能力，又保护核磁共振仪器设备，使用者必须经过严格的操作培训，熟悉仪器设备的性能、工作条件、操作方法及注意事项，考核合格，经授权后方可上机操作。使用时应该填写“大型精密仪器设备使用记录”，未经授权的任何人都不得使用或不得单独使用该仪器设备。

为强化学生的实践能力，充分利用仪器，建立开放实验室是未来大型仪器教学与管理改革的方向。建立完善的大型仪器的开放实验室管理制度，不仅可以将管理人员从繁重的样品测试中解脱出来，还可以大大提高仪器利用率，更重要的是提高学生的实践能力和创新能力，使得学生成为高素质的应用型、创新型人才，同时也培养了一批熟悉仪器设备的性能、工作条件、操作方法的人才，为他们将来步入工作岗位适应社会的发展和需求打下良好的基础，在以上工作的基础上，参考国外先进经验，我们准备利用校园网与仪器相结合，建设核磁平台网络化开放管理系统，包括建立核磁平台主页、网上机时预订系统、数据传递系统、仪器的远程监控系统、网络安全防护系统、电子门禁卡等多个子系统，实现全天候为研究人员、研究生开放服务。仪器管理人员可实现对仪器的远程监控，经过培训并上机操作考核通过的研究生或教师，可以获得独立上机操作资格证，可凭证预订机时，独立上机操作测试样品。核磁谱仪实验室安装门禁电子锁，实验人员预订机时后凭本人门禁卡就能够进入实验室进行样品测试。实验结束后可在自己的实验室中通过网络下载并处理数据、查看、打印谱图，节约了用户占用核磁谱仪上机时间，实现全年全天候开放服务。这种通过网上预约、门禁刷卡进入、自行上机操作完成测试任务的完全开放形式，不仅可以培养更多的人才，也节省了专人测试的操作人员，同时促进了大型仪器的开放使用，提高了大型仪器使用效率。在分析检测中的应用如下：

在天然药物分析中的应用, 天然药物成分纷繁复杂, 随着分析技术的快速发展,越来越多的技术被应用于天然药物研究，核磁共振以其独特的优点得到越来越多的重视。天然药物的研究, 由于其特殊性存在诸多特点。天然药物有效成分含量偏低且存在多种相似物质对分析产生干扰, 以往的分析手段在鉴别相似有机物质时缺乏手段。核磁共振光谱是指纹波谱的一种, 它能够弥补其它分析方法的不足, 在分析天然药物的有效成分、鉴别药物伪劣、分析产物产地、研究栽培和野生药物成分差别以及药物质量控制等方面, 发挥重要作用。天然药物中成分十分复杂, 而有效物质只有一种或数种, 因此这对药物质量的检测提出了很高的要求。传统的方法是对中药进行色谱分析, 而随着多项研究表明, 核磁共振图谱可以很好的表征化学成分特征和相对含量的差异, 且非常可靠, 可以很好地应用于质量检测。德国光谱分析试验室的Bernd Diehi博士等将H-NMR用于芦荟质量检测, 结果表明H-NMR在检测质量方面是非常有效的。野生和栽培药物在成分上总体是相似的,但往往有效成分存在着诸多微小差异。这些微小差异由于理化性质非常相似, 所以普通的分析方法难以区别它们。核磁共振是指纹图谱中的一种,它在鉴定天然药物的优越性和可靠性方面是独特的。它可以有效地鉴别药材真伪和品质优劣。在氘代试剂使用方面，一般使用氘代的H2O、DMSO、CDCl3和CH3OH，对天然药物成分没有影响，且可以完全回收样品。

2.1NMR与生物分子的定量分析

积分曲线高度与引起该组峰的核数呈正比关系。这不仅是对化合物进行结构测定的重要参数之一, 而且也是定量分析的重要依据。用NMR技术进行定量分析的最大优点是: 不需引进任何校正因子或绘制工作曲线, 即可直接根据各共振峰的积分高度的比值求算该自旋核的数目。

2.2NMR与代谢物的动态变化

通过测定和分析在一定时间内依次收集的尿样、血清或其它生物样品,就可以得到器官内代谢物的动态变化模式。利用NMR可以在不做任何物理分离(无损伤性,不破坏样品的结构和性质)和化合物定性分析的条件下, 可在一定的温度和缓冲范围内进行生理条件或接近生理条件的实验, 表征和研究海量的代谢信息及其变化规律(代谢组学), 从而得到丰富生理、药理和毒理等生物学信息。

2.3NMR成象技术与临床检测

NMR成像技术以其无辐射损伤、无破坏性、无试剂侵入、能获得全立体图像等突出优点很快就受到科学界的重视, 技术发展非常迅速。其几乎集各种医学成像的优势于一身, 很快就在临床定位、诊断和治疗监视中发挥了重要作用。对学生有序开放核磁共振波谱仪等大型仪器不仅培养了学生学习与科研的兴趣，更为学生提供了实践学习的条件，又可充分发挥实验室现有资源的作用，提高仪器设备的利用率和使用效益，同时也培养了一大批具有实际操作技能和管理经验的专门人才，以满足社会对高素质应用型人才的需求。

利用核磁谱研究蛋白质，已经成为结构生物学领域的一项重要技术手段。不过核磁常局限于35kDa以下的小分子蛋白，尽管随着技术的进步，稍大的蛋白质结构也可以被核磁解析出来。蛋白质分子量大，结构复杂，一维核磁谱常显得重叠拥挤而无法进行解析，使用二维，三维甚至四维核磁谱，并采用13C和15N标记可以简化解析过程，但同时也使解析谱图过程复杂化。

另外核磁共振与紫外可见光谱和红外光谱相比，灵敏度和精确度相对较低，与传统检测技术的竞争以及设备昂贵测试成本高等原因，核磁共振技术在药物鉴定中的使用频率远不及色谱和质谱等分析技术。通过提高磁场强度，用高灵敏度探头，对谱仪和实验方法进行改进。

3　教学方法改进

目前，药学院药学化学实验中心已经同黑龙江省高校和科研院所等单位的有关实验室建立了良好的合作科研关系，承担了以上单位所主持国家项目，产品研发中的分析测试任务。

第一步：应用现代分析化学方法把教学与核磁共振仪器分析技术相结合，突出核磁共振仪器测定技术应用的知识的重要性，结合实例，使其向熟悉掌握大型现代仪器操作步骤方向过渡。

第二步：核磁共振教学与产品质量控制技术相结合，加强理论知识的同时，注重核磁共振仪器分析方法在实践中应用的介绍，使学生对现代核磁共振仪器分析有初步的了解。

第三步：通过反馈信息，对教学方法进行总结与归纳，使其形成成熟的理论。为了适应教学的要求,我们将编辑一本浅显易懂的现代仪器分析方法教材，这将对我们在的分析化学教学工作中提供非常有利的方便条件。学院积极支持核磁共振教学工作，为了使这项工作顺利进行，学院首先鼓励教师申报教学课程及立项工作，组织教师进行研讨，制定教学方案，并在教学过程中组织学生进入实验室与学生进行交流。教师和学生反馈效果非常好。

综上所述，教研室和实验室老师教学经验丰富，教学理念与课程目标明确，教学理念先进、注重培养学生综合素质的能力，还有学院与学校对教学政策的支持，为教学方法改进的顺利实施提供良好的技术支持。

4　核磁共振实验教学探索

基于以上思路，参考国外先进经验，近几年对我校的400MHz核磁共振仪的教学(主要是实验教学)与管理方式进行以下探索。

4.1在本科生和研究生培养方案中增加核磁共振原理性实验课程

原理性实验课程作为本科生的选修课，主要开展核磁共振氢谱的实验课程；研究生作为必修课，开展核磁共振氢谱、碳谱和DEPT谱的实验课程，安排固定时间上机操作。有专门的教师负责培训，讲解基本操作要求、注意事项，并指导学生完成样品测试，数据处理，获得完整的谱图。课后学生结合理论课知识对谱图进行解析、鉴定样品的化学结构并完成实验报告。主要目的是让学生了解核磁共振仪器的构造及基本工作原理，初步掌握一维谱图的操作及数据处理方法，用实验结果对理论进行验证，加深对理论知识的理解，培养学生对科学研究的兴趣。

4.2针对本科生，开设研究性创新实验课程

在满足日常测试和原理性实验课需要的基础上，安排研究性创新实验课程。为“大学生创新科技计划”、“挑战杯”、“新苗人才计划”提供技术支撑与科研平台。研究性创新实验课程每学期公布开放教学机时，接受自由报名申请。学生自行制定实验内容和实验方案，专业教师对申报的实验方案进行审核，确定后统一安排时间，在管理人员的指导下由学生自行上机操作，实现开放式管理。学生自行制定实验报告、分析实验结果、论证实验过程，并详细记录实验过程中仪器使用方面出现的问题或异常情况并反馈给仪器管理人员，以便与实验室管理人员形成良好的互动和促进，完善仪器的管理。

4.3针对研究生，进行不定期的短期的操作培训，考核合格可独立进行样品测试

部分研究生在科研过程中，具有一定的使用仪器设备的需求，对他们专门开展有针对性的培训。一般每学期至少1次，内容主要是一维和常用二维谱测试的实际操作训练，所有参加培训学生均经过严格的考核，考核合格后获得培训合格证书，为研究生自己上机测试奠定基础。核磁共振仪主要面向科研工作者, 因此该仪器开放对象为经常使用该仪器的本院教师和在读研究生, 不对偶尔测试者开放使用。教学需要时, 仪器管理者更需要把磁体室管好, 组织好教学秩序, 确保在非常安全的情况下开始讲授课程。

目前国内已经有一些单位和学校建立了比较成熟的核磁共振技术操作培训以及仪器网上预约，仪器管理制度，我们向北京大学、中国科学院化学所和知名专家咨询一些好的建议和经验。制定了相应仪器管理制度，采取了专人管理和网上预约。

3年来, 400兆液体核磁共振仪的开放使用极大地提高了各课题组利用该仪器开展分 析测试的积极性。学校每年所发 表的论文中大多数都 得到基金资助, 仪器得到充分使用, 仪器的运行和维护有一定的经费保障, 这极大地调动了仪器管理人员的积极性, 也为其他大型仪器的开放做出了榜样。我们正在加强核心技术队伍建设, 激发技术人员钻研技术的积极性, 使仪器开放工作做得更加完善。

5　致谢

感谢国家自然科学基金项目(21346006), 黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(2015 10222035), 黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12541783), 佳木斯大学交叉学科类科学研究项目(JC2014-005)和佳木斯大学研究生科技创新重点项目(LZR2015_021)对本课题的支持。

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Teaching research on modern nuclear magnetic resonance technique.

Lü Yuguang1, Song Di1,Yu Lili2, Wang Wei’e1, Wang Chaoxing1, Du Mengyuan1, Du Haoran1, Gao Hongbing1, Shi Chunhui3

(1.CollegeofPharmacy,JiamusiUniversity.Jiamusi154007,China;2.InternationalEducationInstitute,JiamusiUniversity.Jiamusi154007,China;3.ClinicalMedicalSchool,JiamusiUniversity.Jiamusi154002,China)

This paper described the purpose of teaching research on modern nuclear magnetic resonance technique and proposed the improving methods.

nuclear magnetic resonance technique; teaching research; analysis and detection; application research

黑龙江省教育科学研究“十二五”规划重点课题(GBB1212070)； 佳木斯大学校长创新创业基金(xzyf2014-18)；佳木斯大学教育科研项目 (JKA2014-042)。

吕玉光, 博士, 教授, 主要研究方向药物分析和光谱分析，E-mail: yuguanglv@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.02.013

2015-10-18