依卡倍特钠对反流性食管炎大鼠食管黏膜的保护作用及可能机制



依卡倍特钠对反流性食管炎大鼠食管黏膜的保护作用及可能机制

目的：探讨依卡倍特钠(ES)对反流性食管炎大鼠食管黏膜病变的保护作用及其机制。方法：采用食管十二指肠吻合术建立大鼠RE模型，进行药物干预。HE染色检测各组大鼠食管黏膜损伤情况；ELISA检测各组大鼠血清炎症因子水平；Real-time PCR检测食管内TNFα、IL-1、Cox2 mRNA表达；Western blot检测食管内ERK及P38通路活化。结果：ES低、中、高浓度干预不同程度缓解了食管黏膜病变，降低血清中TNFα、IL-1β水平及食管中TNFα、IL-1、Cox2表达(P<0.05)，抑制ERK及P38通路的异常活化(P<0.05)。结论：ES通过抑制MAPK信号通路抑制TNFα、IL-1、Cox2的表达,影响炎症因子的释放和炎症发生，从而缓解食管黏膜病变。

胃食管反流病(Gastroesophageal reflux disease, GERD)严重时可导致Barrett食管及食管癌[1]。反流性食管炎(Reflux esophagitis, RE)是胃食管反流病的一种。依卡倍特钠(Ecabet sodium，ES)作为一种胃黏膜保护剂，可以选择性的在胃黏膜损伤处形成保护层，改善内膜局部血流量，增强防御因子的作用，一直主要用于胃炎、胃溃疡的临床治疗[2]，近年来开始进行RE治疗方面的应用。有研究指出其对大鼠RE具有缓解作用[3]，但是具体分子机制尚未清楚。有报道指出，ES可能通过MAPK信号途径保护肠上皮细胞损伤[4]。因此，本文拟建立大鼠混合反流性食管炎及依卡倍特钠治疗模型，研究MAPK信号通路及相关细胞因子变化情况，观察ES对RE的治疗作用是否与该信号通路相关，以期寻找临床治疗RE的理想药物。

材料与方法

1 材 料

1.1 实验动物:健康8周龄SD雄性大鼠70只，体重约200 g，购买自辽宁长生生物技术有限公司。

1.2 实验仪器:微量移液器购自美国Eppendorf公司；离心机为美国Sigma公司产品；光学显微镜购自日本OLYMPUS；石蜡切片机购自德国Leica公司；电热恒温鼓风干燥箱购自上海精宏实验设备公司；电热恒温培养箱购自天津泰斯特公司；超纯水系统购自香港Heal Force公司。

1.3 实验试剂:奥美拉唑为广东逸舒制药有限公司产品；依卡倍特钠为天津田边制药有限公司产品；二甲苯、无水乙醇及曙红Y(醇溶)均为国药集团股份有限公司产品；苏木精为Solarbio公司产品；大鼠血清TNFα及IL-1β ELISA检测试剂盒为Boster公司产品；ERK、p-ERK、P38和p-P38抗体为沈阳万类生物科技有限公司产品。

2 方 法

2.1 大鼠混合反流性食管炎模型建立及药物干预：大鼠于实验前在动物房环境中适应3 d，随机分成对照组、假手术组、模型组、ES干预组(低、中、高剂量)及奥美拉唑(疗效对照)组，每组10只，除对照组和假手术组外，其余组均按食管十二指肠吻合术进行反流性食管炎建模。具体方法为：先予10 %水合氯醛麻醉大鼠，将大鼠仰卧位固定于手术台上，消毒后腹部正中切口，将食管下段分离，保留迷走神经，切断食管，胃贲门端作荷包缝合，将胃旷置，距幽门端约l cm处纵行切开十二指肠壁约0.4～0.5 cm，与食管下端行端侧吻合，然后逐层缝合腹部伤口。对照组不作任何处理，假手术组只开腹不做其他处理，15 min后逐层缝合腹部伤口。模型建立后0 d，ES干预组分别以20 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg给予低、中、高浓度的依卡倍特钠灌胃，疗效对照组以20 mg/kg给予奥美拉唑灌胃，对照组、假手术组、模型对照组给予等体积蒸馏水，每天给药一次连续给药2周。

2.2 苏木精-伊红(HE)染色：各组固定后的食管组织标本，经常规脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋，约5 μm厚连续切片，每组随意取10张切片用于HE染色，每组随意抽取5张切片于200倍光镜下观察并拍照。

2.3 ELISA检测血清中炎症因子TNFα、IL-1β的水平：处死各组大鼠后，取血，于室温下放置30 min左右待其凝固后,于离心机上3000 rpm离心10 min，取血清，参照说明书用TNFα及IL-1β ELISA检测试剂盒检测大鼠血清中TNFα、IL-1β的水平。

2.4 RT-PCR检测食管组织TNFα、IL-1、Cox2 mRNA表达水平：取食管组织，正常提取组织总RNA，行Real time PCR扩增，用β-actin做内参。取5 μl的PCR产物，电泳、染色、成像，用Quantity One软件行灰度分析，目的基因mRNA的表达值用基因产物与内参的灰度比值表示。

2.5 Western blot检测ERK、p-ERK、P38、p-P38的表达及磷酸化：取食管组织，正常提取蛋白质，化学发光法显色，对条带进行吸光度积分扫描。用β-actin做内参。采用目的蛋白吸光度值/内参吸光度值的比值进行比较。

结 果

1 各组大鼠食管粘膜损伤程度 食管组织连续切片HE染色结果显示，对照组大鼠食管未见明显的组织学病变。模型组大鼠食管可见鳞状上皮细胞增生，鳞状上皮的黏膜固有层乳头伸长，部分可见黏膜糜烂或溃疡形成。疗效对照组鳞状上皮未见增生，黏膜尚完整，未见明显糜烂、溃疡等病变，固有膜乳头缩短，固有膜内可见少许慢性炎细胞浸润。ES低浓度干预组大鼠食管黏膜部分区域仍可见糜烂，ES中浓度干预组大鼠的食管黏膜损伤有所改善，而高浓度ES干预组大鼠食管鳞状上皮未见明显细胞病变，黏膜较完整，未见糜烂、溃疡等病变，这与疗效对照组相似(图1)。

图1 各组大鼠食管粘膜病理形态学观察[HE染色;×200；对照组(A)、假手术组(B)、模型组(C)、低剂量ES干预组(D)、中剂量ES干预组(E)、高剂量ES干预组(F)和疗效对照组(G)]

2 各组大鼠血清TNFα、IL-1β炎症因子水平 模型组血清TNFα、IL-1β炎症因子明显高于正常对照组(P<0.001)；对照组TNFα及IL-1β水平明显低于模型组(P<0.01)；低浓度ES干预组TNFα的水平明显低于RE模型组(P<0.05)，而IL-1β的水平与RE模型组无明显差异；中浓度及高浓度ES干预组TNFα、IL-1β的水平均明显低于RE模型组(P<0.05)。此外，高浓度的ES干预组TNFα的水平明显低于对照组(P<0.01)，但IL-1β水平无明显差异(图2)。

3 各组大鼠食管组织TNFα、IL-1、Cox2 mRNA相对表达水平mRNA表达水平 模型组食管组织TNFα、IL-1、Cox2 mRNA表达明显高于对照组(P<0.001)；低、中、高浓度ES干预组TNFα、IL-1和Cox2 mRNA的表达均明显低于模型组(P<0.05)。此外，疗效对照组TNFα、IL-1和Cox2 mRNA的表达均明显低于高浓度的ES干预组(P<0.001)(图3)。

4 各组大鼠食管组织ERK、p-ERK、P38、p-P38蛋白水平 模型组ERK的表达明显高于对照组(P<0.001)，而P38的表达明显低于对照组(P<0.001)，但是p-ERK和p-P38的表达都明显高于对照组(P<0.001)。对照组ERK及P38的表达明显高于对照组(P<0.05)，但是其p-ERK和p-P38的表达都明显低于对照组(P<0.001)。中、低浓度ES干预组ERK的表达与模型组相比无明显差异，高浓度ES干预组ERK的表达明显低于模型组(P<0.05)，但高、中、低浓度ES干预组p-ERK的表达均明显低于RE模型组(P<0.001)；高、中、低浓度ES干预组P38的表达虽然都明显高于模型组(P<0.05或P<0.001)，但其p-P38的表达均明显低于模型组(P<0.001)。这与疗效

对组大鼠食管中ERK、p-ERK、P38、p-P38蛋白的表达情况相似(图4)。

图2 各组大鼠血清TNFα、IL-1β炎症因子水平(与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与疗效对照组相比，&P<0.05，&&P<0.01)

图3 各组大鼠食管组织TNFα、IL-1、Cox2 mRNA表达水平(与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与疗效对照组相比，&P<0.05，&&P<0.01)

图4 各组大鼠食管组织ERK、p-ERK、P38、p-P38蛋白水平(与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与疗效对照组相比，&P<0.05，&&P<0.01)

讨 论

反流性食管炎(RE)容易长期、反复发作，能够并发溃疡、出血、穿孔以及Barrett食管等，严重者能够发展成食管腺癌，严重影响患者生活质量[5]。

依卡倍特钠(ES)是一种胃黏膜保护剂，主要用于胃炎、胃溃疡的临床治疗[2]，近年来有研究指出其对大鼠RE具有缓解作用[3]。奥美拉唑是临床治疗RE的代表药物之一[6],因此选作疗效对照。为探究ES治疗RE的分子机制，本研究采用食管十二指肠吻合术建立大鼠RE模型，比较了ES干预前后各组大鼠食管黏膜的病理学变化。结果显示，与正常对照组相比，模型组呈现明显的食管黏膜炎症表现，说明食管十二指肠吻合术可成功建立大鼠RE模型；经ES干预治疗后，RE模型组上皮增生、糜烂和溃疡均有不同程度减轻。可见，ES对RE模型大鼠受损食管黏膜确有保护和修复作用。研究表明，多种促炎性细胞因子在RE的发生发展中发挥重要作用[7]。Ku等人[8]通过仙茅根茎提取物缓解RE大鼠食管损伤，同时降低了TNFα、IL-1及IL-6的表达。本实验结果显示，ES干预显著降低模型组大鼠血清及食管TNFα、IL-1水平，提示ES可能通过抑制TNFα、IL-1β等炎症因子的表达缓解RE模型中的食管损伤。环氧合酶-2(Cox2)与炎症性疾病的关系非常密切。Hayakawa等[9]的研究证实Cox2在反流性食管炎的致病机制中发挥重要作用。本实验中，ES干预显著降低模型组食管Cox2的升高，提示ES可通过抑制Cox2的表达减少炎症反应，从而缓解RE模型中的食管损伤。文献表明，抑制P38 MAPK信号通路的激活可以缓解RE大鼠的食管粘膜损伤[10]，说明P38 MAPK信号通路可能参与RE的病理进程。在本实验中，ES干预能够显著抑制模型组大鼠ERK和P38的异常活化，提示ES可能通过抑制ERK和P38的磷酸化参与RE模型中的食管损伤修复。

综上，ES通过抑制MAPK信号通路影响TNFα、IL-1、Cox2的表达，进而抑制炎症因子的释放和炎性反应，缓解RE模型中的食管黏膜病变。本研究探讨了ES缓解RE食管损伤的分子机制，可为临床预防及治疗RE提供重要的理论依据及实验基础。

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(收稿：2016-03-18)

中国医科大学附属第一医院(沈阳 110001) 杨 柳 孙明军 黄玉红△

Esophageal mucosa protective effects and its mechanism of Ecabet sodium in rat reflux esophagitis

The First Hospital of China Medical University(Shenyang 110001) Yang Liu Sun Mingjun Huang Yuhong

Objective: To inquire into the esophageal mucosa protective effects of Ecabet sodium(ES) in rat reflux esophagitis (RE) and its possible mechanism. Methods: The operation of end-to-side anastomosis of the esophagus and duodenum was performed to establish rat RE model. Esophageal mucosa lesion was examined by HE stain. The level of TNFα and IL-1β in sera was determined by ELISA. The level of TNFα, IL-1 and Cox2 in esophageal tissues were detected by Real-time PCR. The activation of ERK and P38 was detected by western blot. Results: Low, middle and high concentration ES intervention showed different levels of alleviation of esophageal mucosa disease, decreased the level of TNFα and IL-1β in serum and TNFα, IL-1, Cox2 in esophagus (P<0.05). Otherwise, ES inhibited the abnormality activation of ERK and P38(P<0.05). Conclusion: By inhibiting the MAPK signaling pathways and suppress the expression of TNFα, IL-1 and Cox2, ES thereby inhibits the release of inflammatory cytokines and inflammation, and as a result reduces esophageal mucosal lesions in RE model.

Ecabet sodium Reflux Esophagitis/drug therapy Demullents/pharmacology Gastroesophageal reflux @MAPK signaling pathway Rats

食管炎/药物疗法 黏膜保护剂/药理学 胃食管反流 @MAPK信号通路 大鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.004

△通讯作者