3种不同产地灵芝子实体粗多糖体外抗氧化活性比较研究

陈 杰,董 扬,鲁吉珂,陈 强,耿战辉,张黎明,郝利民,*,贾士儒,*

(1.天津科技大学,工业发酵微生物教育部重点实验室,天津 300457;2.总后勤部军需装备研究所,北京 100010;3.郑州大学生命科学学院,河南郑州 450001)



3种不同产地灵芝子实体粗多糖体外抗氧化活性比较研究

陈 杰1,董 扬1,鲁吉珂2,3,陈 强2,耿战辉2,张黎明1,郝利民1,*,贾士儒1,*

(1.天津科技大学,工业发酵微生物教育部重点实验室,天津 300457;2.总后勤部军需装备研究所,北京 100010;3.郑州大学生命科学学院,河南郑州 450001)

采用2,2′-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除法、羟基自由基清除法和铁氰化钾法4种方法,分别对3种不同产地(安徽金寨、吉林通化、吉林蛟河)灵芝子实体粗多糖的体外抗氧化活性进行评价。结果表明,3种灵芝子实体粗多糖均具有抗氧化能力。安徽金寨灵芝子实体粗多糖对ABTS自由基、DPPH自由基的清除能力最强,其对应EC50值分别为1.50 mg/mL和2.09 mg/mL,同时也具有最强的总还原力;吉林通化灵芝子实体粗多糖对羟基自由基的清除能力最强,其EC50值是2.13 mg/mL;吉林蛟河灵芝子实体粗多糖的体外抗氧化活性均最低。因此,不同产地灵芝子实体粗多糖的抗氧化活性不同。

灵芝子实体,粗多糖,抗氧化活性,自由基

灵芝(Ganodermalucidum)是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌,在中国古称瑞草,也叫长生草,仙草、灵草等,是我国传统的扶正固本、滋补强壮的名贵中药[1]。灵芝的主要活性组份有多糖类、三萜类、多肽类和核苷类等。多糖是由至少10个以上的单糖结合组成的聚合糖高分子碳水化合物,是生命有机体的重要组成部分。灵芝多糖是灵芝的主要活性成份,具有抗肿瘤、抗炎[2]、抗氧化[3]、调节机体免疫[4]等多种生物活性。近年来,灵芝多糖的抗氧化活性已有广泛的研究。游丽君等[5]比较了传统热水提取法、超声波法、超声波结合纤维素酶法和超声波结合胰酶法四种方法提取的灵芝多糖的抗氧化活性差异,结果表明超声波结合胰酶法提取的灵芝多糖具有较好的抗氧化活性。游育红等[6]研究了灵芝多糖对人脐静脉内皮细胞株ECV304氧化损伤的保护作用,结果显示灵芝多糖可减少氧自由基对细胞器的损伤,能很好地抑制细胞凋亡,证实了灵芝多糖具有保护细胞氧化损伤的作用。尽管已有研究表明灵芝多糖具有良好的抗氧化作用,但对不同产地灵芝子实体多糖体外抗氧化活性的比较研究相对较少。因此,从不同产地的灵芝子实体中提取多糖,并对其体外抗氧化活性进行比较,可为不同产地灵芝多糖功能食品的进一步开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

灵芝子实体 均为人工栽培的赤芝,分别采自安徽金寨灵芝种植基地、吉林通化灵芝种植基地、吉林蛟河灵芝种植基地。

葡萄糖、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、水杨酸 天津市北方天医化学试剂厂;过硫酸钾、30%H2O2、三氯乙酸、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、维生素C(VC) 国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇 天津市四通化工厂;铁氰化钾 天津大茂化学试剂厂;氯化铁 天津市双船化学试剂厂;硫酸亚铁 天津市新欣化工厂;苯酚 北京鼎国生物有限责任公司;2,2′-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美国Sigma-Aldirch公司。以上试剂均为分析纯。

UVmini-1240型紫外可见分光光度计 岛津国际贸易(上海)有限公司;JA12002型电子天平 上海精科天平仪器厂;RE-3000型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;QL-902型漩涡振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;TF-J型冷冻干燥机 北京诺比邻电子信息技术有限公司;TDA-8002型恒温水浴锅 天津市中环实验电炉有限公司;SBS Z100型数控计滴自动部份收集器 上海沪西仪器总厂;SH-D(Ⅲ)型真空泵 河南予华仪器有限公司;WND-200型高速中药粉碎机 浙江省兰溪市伟能达电器有限公司;Rapid N CUBE型杜马斯燃烧定氮仪 德国Elementar公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 以葡萄糖为标准品,采用苯酚硫酸法绘制标准曲线[7]。

1.2.2 多糖得率的测定 采用付立忠[8]的方法提取灵芝子实体粗多糖:灵芝子实体在60 ℃下烘干至恒重,粉碎,过20目筛。准确称取0.5 g样品,加入35 mL蒸馏水,沸水浴加热3 h,冷却至室温后离心,收集上清液备用,残渣按上述方法进行二次提取。合并两次上清液,准确吸取5.0 mL置于50 mL离心管中,加入20 mL无水乙醇,混匀后在4 ℃下静置约6 h。然后4000 r/min离心20 min,弃去上清液,取沉淀并用无水乙醇润洗3次。再将沉淀用水充分溶解,定容到25 mL。吸取2.0 mL样品,加入6%苯酚1.0 mL,混匀后加入5.0 mL浓硫酸,拌匀。室温放置5 min,然后在沸水浴中保温15 min,用自来水冷却5 min,混匀后于波长490 nm处测定吸光度。根据苯酚硫酸法标准曲线,先计算出提取液中的多糖质量浓度,然后按式(1)计算出灵芝子实体的多糖得率。

多糖得率(%)=多糖质量浓度×体积×稀释倍数/原料质量×100

式(1)

1.2.3 粗多糖中总糖含量的测定 分别称取3种灵芝子实体粗多糖0.005 g,加适量蒸馏水溶解,再定容到100 mL,摇匀,即得供试品溶液。吸取2.0 mL样品,按照1.2.2的方法进行苯酚硫酸法测定。根据标准曲线计算出溶液的多糖质量浓度,然后由式(2)计算出粗多糖中的总糖含量。

总糖含量(%)=多糖质量浓度×体积×稀释倍数/粗多糖质量×100

式(2)

1.2.4 粗多糖中蛋白质含量的测定 采用杜马斯燃烧法[9]测定灵芝子实体粗多糖中蛋白质的含量,方法如下:分别称取3种灵芝子实体粗多糖约0.25 g,用锡箔纸包好,制成锡箔药片,置于自动进样盘里。将杜马斯定氮仪设置成如下条件:一级燃烧管温度为960 ℃;二级燃烧管温度为800 ℃;还原管温度为815 ℃。样品进入仪器中,先在纯氧条件下充分燃烧生成氮氧化合物,然后氮氧化合物在还原管中被还原为氮气,进入TC检测器中检测。根据仪器检测得出测试样品的总氮含量,按式(3)计算出粗多糖中的蛋白质含量。

蛋白质含量(%)=总氮含量×6.25

式(3)

1.2.5 粗多糖中水分含量的测定 分别称取3种灵芝子实体粗多糖约2.0 g,按照GB/T 5009.3-2010《食品中水分的测定》中的减压干燥法测定[10]。

1.2.6 粗多糖体外抗氧化活性的测定 将提取的灵芝子实体粗多糖冻干样品分别配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的水溶液。阳性对照VC和BHT作同样处理。

1.2.6.1 ABTS自由基清除能力测定 ABTS经过硫酸钾氧化后会生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+·,其在734 nm处有最大吸收。自由基清除剂与ABTS+·发生反应使反应体系褪色,可根据褪色程度判断其抗氧化能力[11]。

步骤如下:将相同体积的7 mmol/L的ABTS和 2.45 mmol/L过硫酸钾混合,避光反应 12～16 h,得到ABTS+·溶液。用水稀释该溶液使其在734 nm下的吸光度值在(0.70±0.02)。试管中加入 0.5 mL灵芝子实体粗多糖溶液,然后加ABTS+·溶液定容到10 mL,摇匀,在室温下放置6 min,于734 nm处测吸光度。以VC和BHT作为阳性对照。按式(4)计算ABTS自由基清除率:

式(4)

式中:A0-空白对照吸光度(0.5mL水,加ABTS+·溶液定容到10mL);Ai-样品组吸光度(0.5mL样品,加ABTS+·溶液定容到10mL);Aj-样品本底吸光度(0.5mL样品,加水定容到10mL)。

1.2.6.2DPPH自由基清除能力测定DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的质子自由基,可用来测定抗氧化剂的抗氧化能力。DPPH自由基乙醇溶液呈紫色,在517nm处有强烈吸收。自由基清除剂能提高电子与DPPH的孤对电子配对,使其溶液褪色,其褪色程度与其接受的电子呈定量关系,可根据褪色程度判断抗氧化能力[12]。

步骤如下:试管中加入1.0mL0.6mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液和1.0mL灵芝子实体粗多糖溶液,再用60%乙醇定容至10mL,混匀后避光反应30min,于517nm处测吸光度。以VC和BHT作为阳性对照。按式(5)计算DPPH自由基清除率:

式(5)

式中:A0-空白对照吸光度(60%乙醇代替样品溶液);Ai-样品组吸光度;Aj-样品本底吸光度(无水乙醇代替DPPH自由基溶液)。

1.2.6.3 羟基自由基清除能力测定 Fe2+和H2O2混合后会发生Fenton反应,产生·OH。当加入水杨酸后,能有效地捕捉·OH产生紫红色产物。该产物在510 nm处有强吸收,自由基清除剂的加入会与水杨酸竞争,从而使有色产物的生成量减少,采用固定反应时间法,在510 nm处测定反应液吸光度,便能确定被测物对羟基自由基的清除率[13]。

表1 灵芝子实体的粗多糖得率及其粗多糖组成(%)Table 1 Extraction yield and the composition of crude polysaccharide of three Ganoderma lucidum(%)

步骤如下:试管中依次加入9.0 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1.0 mL、9.0 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、灵芝子实体粗多糖溶液1.0 mL。之后再加8.8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL启动反应,37 ℃水浴反应30 min,在510 nm处测吸光度。以VC和BHT作为阳性对照。按式(6)计算羟基自由基清除率:

式(6)

式中:A0-空白对照吸光度(蒸馏水代替样品溶液);Ai-样品组吸光度值;Aj-样品本底吸光度值(蒸馏水代替H2O2)。

1.2.6.4 总还原力测定 赤血盐(K3Fe(CN)6)先被还原剂还原为黄血盐(K4Fe(CN)6),然后黄血盐与Fe3+反应,生成普鲁士蓝。普鲁士蓝的生成量可以通过测定700 nm处吸光度来表征,吸光度越大,普鲁士蓝的生成量越多,表明还原剂的总还原力越大。抗氧化剂是通过给出电子发挥总还原力进而达到清除自由基的目的,总还原力越强,其抗氧化能力就越强。因此,可以通过测定总还原力来表征其抗氧化能力[14]。

步骤如下:试管中依次加入灵芝子实体粗多糖溶液2.5 mL、铁氰化钾溶液(1.0%,w/v)2.5 mL、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.6)2.5 mL,混合均匀。然后将混合液50 ℃水浴反应20 min,接着向混合液中加入2.5 mL的三氯乙酸溶液(10%,w/v),5000 r/min离心10 min后取5.0 mL上清液,再加入0.5 mL的三氯化铁溶液(0.1%,w/v)在700 nm处测吸光度。以VC和BHT作为阳性对照。按式(7)计算总还原力:

总还原力=Ai-Aj

式(7)

式中:Ai-样品组吸光度值;Aj-样品本底吸光度值(蒸馏水代替三氯化铁溶液)。

1.2.7 统计分析方法 实验重复3次,实验结果用X±SD表示,实验数据采用SPSS11.0统计软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以葡萄糖为标准品,绘制苯酚硫酸法标准曲线,得线性回归方程:A=0.0102C-0.0044,r=0.9988。式中,A为吸光度,C为葡萄糖质量浓度/(mg/mL),吸光度和葡萄糖质量浓度在0～90 mg/mL范围内有良好的线性关系。

2.2 灵芝子实体的粗多糖得率及其组成

灵芝多糖是灵芝中的主要活性物质,也是灵芝产品质量控制的重要指标[15]。3种灵芝子实体的粗多糖得率及其组成结果见表1。由表1可知,在实验提取条件下,安徽金寨灵芝子实体的粗多糖得率(1.55%)高于另外两种灵芝子实体,吉林通化灵芝子实体的粗多糖得率最低,为1.38%。3种灵芝子实体粗多糖的总糖含量比较接近,在80%左右。水提粗多糖中常含有部分游离蛋白质和糖蛋白,蛋白质含量也是粗多糖的一个重要检测指标[16]。由于本研究中没有除蛋白步骤,3种灵芝子实体粗多糖中均含有一定的蛋白质,但含量均不高,在5%左右。此外,3种灵芝子实体粗多糖均含有一定的水分,其中吉林蛟河灵芝子实体粗多糖的水分含量最高(10.57%)。

2.3 灵芝子实体粗多糖体外抗氧化活性

2.3.1 ABTS自由基清除能力 不同浓度下灵芝子实体粗多糖对ABTS自由基的清除率如图1所示。由图1可知,3种灵芝子实体粗多糖对ABTS自由基都具有清除作用,且其清除能力呈现一定的剂量依赖性。在浓度为2 mg/mL时,安徽金寨灵芝子实体粗多糖、吉林通化灵芝子实体粗多糖对ABTS自由基的清除率都达到50%以上,而吉林蛟河灵芝子实体粗多糖的清除率为29.14%。在浓度为5 mg/mL时,安徽金寨灵芝子实体粗多糖、吉林通化灵芝子实体粗多糖对ABTS自由基的清除率都接近100%,而吉林蛟河灵芝子实体粗多糖的清除率为70.56%。在所测浓度范围内,VC和BHT对ABTS自由基的清除率都接近100%,整体上高于3种灵芝子实体粗多糖。安徽金寨灵芝子实体粗多糖对ABTS自由基清除能力最强,吉林蛟河灵芝子实体粗多糖最弱(图1)。

图1 灵芝子实体粗多糖对ABTS自由基的清除作用(n=3)Fig.1 ABTS radical scavenging activity of crude polysaccharides of three Ganoderma lucidum(n=3)

2.3.2 DPPH自由基清除能力 不同浓度下灵芝子实体粗多糖对DPPH自由基的清除率如图2所示。由图2可知,3种灵芝子实体粗多糖对DPPH自由基均具有清除作用,且其清除能力呈现一定的剂量依赖性。在浓度为1～3 mg/mL范围内,3种灵芝子实体粗多糖的清除率接近;在浓度为5 mg/mL时,吉林通化灵芝子实体粗多糖的清除能力高于另外两种灵芝子实体粗多糖。在所测浓度范围内,VC和BHT对DPPH自由基的清除率基本上保持不变,高于3种灵芝子实体粗多糖。

图2 灵芝子实体粗多糖对DPPH自由基的清除作用(n=3)Fig.2 DPPH radical scavenging activity of crude polysaccharides of three Ganoderma lucidum(n=3)

2.3.3 羟基自由基清除能力 不同浓度下灵芝子实体粗多糖对羟基自由基的清除率如图3所示。由图3可知,在相同浓度下,对羟基自由基清除能力由强到弱的顺序依次是吉林通化灵芝子实体粗多糖、安徽金寨灵芝子实体粗多糖、吉林蛟河灵芝子实体粗多糖。在所测浓度范围内,VC对羟基自由基的清除率接近100%,而BHT对羟基自由基的清除率最低。

图3 灵芝子实体粗多糖对羟基自由基的清除作用(n=3)Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activity of crude polysaccharides of three Ganoderma lucidum(n=3)

2.3.4 总还原力 不同浓度下灵芝子实体粗多糖总还原力如图4所示。由图4可知,粗多糖浓度在1～4 mg/mL范围内时,3种灵芝子实体粗多糖的总还原力随浓度提高而增加;但当粗多糖浓度高于4 mg/mL后,其随浓度提高增速减缓。VC和BHT的总还原力相近,高于3种灵芝子实体粗多糖。在5 mg/mL时,安徽金寨灵芝子实体粗多糖和吉林通化灵芝子实体粗多糖的总还原力与VC、BHT相近,分别为2.56和2.55,均高于吉林蛟河灵芝子实体粗多糖。在相同浓度下,3种粗多糖总还原力由高到低的顺序依次是安徽金寨灵芝子实体粗多糖、吉林通化灵芝子实体粗多糖、吉林蛟河灵芝子实体粗多糖。

图4 灵芝子实体粗多糖的总还原力(n=3)Fig.4 Total reducing power of crude polysaccharides of three Ganoderma lucidum(n=3)

2.3.5 三种抗氧化指标的EC50值比较 将3种灵芝子实体粗多糖对ABTS自由基、DPPH自由基和羟基自由基3种自由基的抗氧化曲线分别进行曲线拟合后得到各样品各指标的EC50值,结果见表2。

表2 灵芝子实体粗多糖抗氧化活性指标的EC50值Table 2 EC50 index of antioxidant activities of crude polysaccharides of three Ganoderma lucidum

ABTS自由基清除能力比较:安徽金寨灵芝子实体粗多糖的EC50值最小,为1.50 mg/mL,对ABTS自由基的清除能力最强,然后依次为吉林通化灵芝子实体粗多糖、吉林蛟河灵芝子实体粗多糖。

DPPH自由基清除能力比较:3种灵芝子实体粗多糖的EC50值分别为2.09 mg/mL(安徽金寨)、2.24 mg/mL(吉林通化)、2.54 mg/mL(吉林蛟河),说明3种灵芝子实体粗多糖对DPPH自由基的清除能力不同。真菌多糖清除DPPH自由基的研究结果显示,田野蘑菇、罗马尼斯蘑菇、白林地菇、林地蘑菇、双孢蘑菇粗多糖清除DPPH自由基的EC50值分别为15.85、6.22、6.39、5.37、9.61 mg/mL[17],均远高于这3种灵芝子实体粗多糖的EC50值。因此灵芝子实体粗多糖对DPPH自由基的清除能力可能优于上述几种食用菌粗多糖。此外,3种灵芝子实体粗多糖对DPPH自由基清除能力还优于松乳菇、灰褐纹口蘑提取物[17]。

羟基自由基清除能力比较:3种灵芝子实体粗多糖的EC50值依次为2.13 mg/mL(吉林通化)、2.55 mg/mL(安徽金寨)、3.05 mg/mL(吉林蛟河)。王峰等[18]测定了金顶侧耳、大球盖菇、姬菇、柳松菇四种食用菌粗多糖的羟基自由基清除率,其EC50值分别是2.36、3.71、2.60、3.95 mg/mL,这3种灵芝子实体粗多糖对羟基自由基的清除能力与上述几种食用菌粗多糖接近。

3 结论

3种灵芝子实体粗多糖得率比较接近,其中安徽金寨灵芝子实体粗多糖得率为1.55%,略高于其它2种灵芝子实体。3种灵芝子实体粗多糖的总糖含量均在80%左右,蛋白质的含量均在5%左右,水分含量均在10%左右。粗多糖中的主要成分是多糖,蛋白质的含量较低。

另外,3种灵芝子实体粗多糖均具有抗氧化活性。安徽金寨灵芝子实体粗多糖清除ABTS自由基、DPPH自由基和总还原力优于其他2种灵芝子实体粗多糖;吉林通化灵芝子实体粗多糖对羟基自由基的清除能力最强;吉林蛟河灵芝子实体粗多糖的抗氧化活性均最低。综合比较,安徽金寨灵芝子实体粗多糖的体外抗氧化活性最强。

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Study oninvitroantioxidant activities of crude polysaccharides of threeGanodermalucidumfrom different origins

CHEN Jie1,DONG Yang1,LU Ji-ke2,3,CHEN Qiang2,GENG Zhan-hui2,ZHANG Li-ming1,HAO Li-min1,2,*,JIA Shi-ru1,*

(1.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of education,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2.The Quartermaster Equipment Institute of General Logistics Department of People’s Liberation Army,Beijing 100010,China;3.School of Life Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China)

Inordertocomparethein vitroantioxidantactivitiesofcrudepolysaccharidesofthreeGanoderma lucidumfromdifferentorigins,ABTSradicalscavengingactivities,DPPHradicalscavengingactivities,hydroxylradicalscavengingactivitiesandK3Fe(CN)6reductionmethodswereemployed.Theresultsshowedthatthethreedifferentcrudepolysaccharideshadcertainabilitiesofantioxidantactivities.ThecrudepolysaccharideextractedfromJinZhai(AnhuiProvince)showedthestrongestcapacityforscavengingABTSandDPPHradical(EC50of1.50mg/mLand2.09mg/mL)andtotalreducingactivity.ThecrudepolysaccharideobtainedfromTongHua(JilinProvince)showedthemostpotentcapacityforscavenginghydroxylradicalwithEC50valueof2.13mg/mL.TheantioxidantcapacityofthecrudepolysaccharidefromJiaoHe(JilinProvince)wasthelowestamongthreecrudepolysaccharides.Therefore,theantioxidantactivitiesofcrudepolysaccharidesofGanoderma lucidumfromdifferentoriginsweredifferent.

Ganoderma lucidum;crudepolysaccharides;antioxidantproperty;freeradical

2016-04-21

陈杰(1990-)，男，硕士研究生，研究方向:发酵工程原理,E-mail:chenjie19900326@126.com。

*通讯作者:郝利民(1969-)，男，博士，教授，高工，研究方向:军用功能食品与食品生物技术，E-mail:hlm2005@163.com。 贾士儒(1954-)，男，博士，教授，研究方向:生物反应工程,E-mail:jiashiru@tust.edu.cn。

TS201.2

A

1002-0306(2016)21-0100-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.011