葡萄胎诊断进展与STR基因分型的应用

刘岩 刘从容

葡萄胎 (hydatidiform mole)是妇科病理中常见的妊娠滋养细胞疾病 (gestational trophoblastic disease)。尽管组织学对充分发育的完全性葡萄胎的诊断基本可靠，但早期完全性葡萄胎常常被临床和病理医生误诊为流产性绒毛水肿或正常妊娠。临床实践中，部分性葡萄胎的诊断存在更多问题，低诊断和过诊断的现象同时并存［1］。葡萄胎具有发展为持续性滋养细胞疾病 (侵袭性葡萄胎和绒癌等)的危险性，且完全性葡萄胎的进展率 (15%～20%)比部分性葡萄胎 (＜4%)更高，因此鉴别葡萄胎和非葡萄胎水肿性流产、进一步区分完全性和部分性葡萄胎具有重要的临床意义［2－3］。此外，葡萄胎的过度诊断会给患者带来不必要的精神和医疗上的负担和后果，导致有迫切生育需求的高龄孕妇不得不面临随着年龄的增长而受孕概率降低的局面。众所周知，形态学鉴别早期葡萄胎缺乏准确性，使用更加准确的葡萄胎诊断方法是进行临床诊断、流行病学以及生物学研究的保证。DNA倍体分析和P57免疫组化染色可以提供一定程度的辅助作用［4－5］，但在医学实践中会遇到不少的困难和陷阱。因此，临床迫切需要提高葡萄胎诊断手段的敏感性和特异性。葡萄胎的发病机理有其独特的遗传学背景，遗传学分型被认为是最终诊断葡萄胎的“金标准”。近数年来STR的多态性分析被证实为最为准确且实用的葡萄胎诊断和分型手段［6－7］。

一、葡萄胎的病因及发病机制

1．历史回顾

葡萄胎是最早被人类描述并认知的疾病之一，最初的文字记载可追溯至2500年前，古希腊的希波克拉底将葡萄胎描述为“因饮用不洁水导致的子宫水肿”。约1500年前，来自美索不达米亚的医生Aetius of Amida将这种伴有乳房胀痛和闭经的疾病命名为“mola hydatidosa”，分别起源于拉丁语“mole”和希腊语“hydatisia”，意为“充满水的囊泡”，这也成为目前使用的“水泡状胎块” (hydatidiform mole)一词的由来。公元十七世纪，Samuel Degys对荷兰女伯爵Margaret of Henneberg传说的思考展示了当时人们对葡萄胎的进一步了解［8］，女伯爵因羞辱了一个怀有双胞胎的穷苦女乞丐而受到上帝的惩罚，她诬陷这对双胞胎是女乞丐与两个不同的男人所生，因此女伯爵在耶稣受难日产下了365个“孩子”(其实为不计其数的囊状水泡)之后随即死去，而她的孩子中一半为男性，一半为女性。以现代医学的角度可以判断，这位女伯爵是一位典型的完全性葡萄胎患者，上帝对她的“惩罚”其实是无核卵子与两个不同的精子受精而导致的滋养细胞疾病。尽管这个传说源于700多年以前，反映出当时人类对葡萄胎的认识还处于蒙昧阶段，但是它的情节完全契合了目前公认的葡萄胎发生的遗传学机制。

随着近代医学的发展和显微镜的使用，人们逐渐认识到葡萄胎中所见到的所谓“葡萄”，事实上是因水肿而膨胀的绒毛膜绒毛，葡萄胎的组织学基础是合体滋养细胞和细胞滋养细胞的增生。直至上世纪七十年代，细胞遗传学首次证实了完全性葡萄胎具有雄源性本质［9］，即完全性葡萄胎只含有父源性基因组，而不含有母源性基因。随后分子遗传学彻底揭示了葡萄胎的病因和发病机制，即亲代基因组在胎盘的发育过程中扮演不同的角色，基因组印迹异常是导致妊娠滋养细胞疾病，尤其是葡萄胎和绒毛膜癌发生的重要基础［10－11］。

2．胎盘部位的“父母利益冲突”

亲代基因组，即父源性基因组和母源性基因组，在胎儿和胎盘的发育过程中扮演不同的角色。在进化过程中，父源性基因组力图操纵母体，使其子代获得更多的资源和绝对的生长优势，与之相反，母源性基因组则力求对子代的基因资源分配保持平衡，为她所有的孩子提供等量的营养，并且阻止子代中的父源性基因对母体的绝对操控和伤害［12］。研究结果表明，母源性基因组对于胚胎的发育是重要的，而父源性基因组对于胚胎外组织，即胎盘的发育是必需的，只有在父母的基因型以正确形式互相平衡时，才会有胎儿的正常发育。哺乳动物的发育需要父母两方的基因组进行精细协调才能达成，走错一步，一切都前功尽弃。正如一场拔河比赛 (tug-ofwar)，如果一方丢掉绳子，双方就都会栽倒。这一观点促进了基因组印迹 (genomic imprinting)理论的创立，该理论解释了为何某些特定基因会根据来自于你的父亲还是母亲而获得不同的表达。在此理论的助力之下，我们便能看清父母之间那些基因利益的争斗是怎样在其后代的基因组中进行到底的。“父母利益冲突”假说认为，在胎盘部位，父源性印迹基因组促进滋养细胞的增殖和侵袭，而母源性印迹基因相对抑制滋养细胞的生长［13］。因此若干父源性基因在正常胎盘中受基因印迹而归于沉默，而母源性等位基因得以表达，两者形成平衡，既不妨碍胎儿的正常发育又保证了母体的生命安全。在妊娠期，一个正常的、平衡的基因组印迹过程被破坏，母源性等位基因的缺乏或父源性印迹基因的表达相对过剩，可能引发异常的滋养细胞增生和侵袭，进而导致葡萄胎等妊娠滋养细胞疾病的发生

3．葡萄胎的发病机制和遗传学基础

在遗传学水平，葡萄胎妊娠具有异常的父源染色体成分，存在过剩的父源性基因组是完全性和部分性葡萄胎发病机制的关键遗传因素。

与正常的单卵、单精子二倍体 (46，XX或XY)妊娠不同，几乎所有的完全性葡萄胎(complete hydatidiform mole)是仅含父源染色体的双精子二倍体［1，14］:它们多数是一个空卵与一个精子受精后再复制的46，XX二倍体核型 (单精纯合子，占80%)，或者是一个空卵与一个减数分裂失败的精子或两个不同的精子同时受精的46，XX或46，XY二倍体核型 (双精杂合子，占20%)。值得注意的是，双精杂合子比双精纯合子的完全性葡萄胎更容易发生恶性转化，进展为持续性滋养细胞疾病。卵子丢失母源性单倍体基因组的原因尚未完全清晰，可能因为卵子不成熟或老化而不能保有自身的核物质，或者在受精过程中母源性核被当做极体而排出细胞外，这种假设与葡萄胎的年龄危险因素(＜20岁或＞40岁)不谋而合。还有一类极为特殊的双亲源性完全性葡萄胎，具有正常比例的双亲基因组，但由于基因印迹调控相关的特定基因 (NALP7或KHDC3L基因)发生了遗传性突变，导致母源性基因被异常灭活而发生完全性葡萄胎。在这种家系中，超过一个以上的女性 (母女或姐妹)在多次妊娠中反复发生完全性葡萄胎，目前见于文献报道的仅有 30 余个家系［15］。

部分性葡萄胎 (partial hydatidiform mole)的遗传学本质是具有双雄单雌性基因组的三倍体，它们来自一个具有单倍体核的卵子同时与两个精子受精(双精杂合子，占90%)，或是由一个具有单倍体核的卵子与一个精子受精，随后由于减数分裂失败而发生父源性染色体倍增 (单精纯合子，占10%)，由此产生二倍父源和单倍母源 (69，XXX或69，XXY核型)的三倍体妊娠［1，14］。值得注意的是，并非所有的三倍体妊娠都表现为部分性葡萄胎。三倍体核型是最常见的人类染色体异常，三分之二为双倍的父源性雄性基因组并且与部分性葡萄胎表型相关，其余则是由于减数分裂过程中母体染色体未分离而形成的双雌单雄性基因组，并非葡萄胎妊娠，这种非葡萄胎型三倍体，额外拥有一组来自于母体的染色体基因组，因此并不会表现出双雄单雌性部分性葡萄胎的生物学和临床特征。有趣的是，在那些能够形成完整胎儿并出现胎死宫内的病例中，双雌性三倍体的比例更高。但由于妊娠早期流产的绒毛发育尚不充分，组织学形态特征不明显，只依据常规的病理检查而不使用其他辅助检测方法，大量病例可能会被漏诊。因此，明确一个三倍体妊娠中父源性染色体的倍数对诊断部分性葡萄胎十分重要。

二、葡萄胎诊断中辅助技术的应用

为了提高葡萄胎诊断的准确性，人们探索了多种针对葡萄胎遗传学变化的分子检测手段。其中包括传统的流式DNA倍体分析、常用的P57免疫组化染色和新兴的基因多态性分析 (STR基因分型)。

1．流式DNA倍体分析

流式DNA倍体分析曾经是葡萄胎诊断的主要辅助技术。通过显示三倍体的核型，流式倍体分析常用于从完全性葡萄胎和非葡萄胎性水肿性流产中鉴别部分性葡萄胎［16］。但此方法不能明确妊娠绒毛组织中染色体的亲本来源，因此无法区分均为二倍体核型的完全性葡萄胎和非葡萄胎性水肿性流产，也无法区分均为三倍体的部分性葡萄胎和双雌单雄性非葡萄胎三倍体流产。如前所述，双雄单雌的部分性葡萄胎仅占所有三倍体流产的三分之二，因此流式分析检测出的三倍体核型只能协助、但不能确诊部分性葡萄胎，更不可能分辨出究竟是单精纯合型还是双精杂合型部分性葡萄胎［17］。此外，倍体分析组织标本常遇到技术困难和解读错误。尤其是石蜡包埋组织容易出现细胞碎片和倍体直方图峰值增宽，并伴有系数波动等技术上的人工假象，不同的固定剂和固定条件也对DNA倍体分析具有明显影响，这些都会造成结果偏差而导致葡萄胎的误诊［18］。

2．P57免疫组化染色

P57是细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白，负性调节细胞周期和抑制增殖。在胎盘部位，父源性P57属于印迹基因而不能表达，仅有母源性P57等位基因得以表达，因此细胞核表达P57蛋白可作为胎盘部位有无母源性基因的标志物［19］。作为胎盘绒毛生长的源动力，细胞滋养细胞和绒毛间质细胞常常是父源性基因印迹的代表，也是评判P57阳性与否的评判对象。母体蜕膜细胞持续性表达母源性基因，可作为P57染色的阳性内对照。绒毛表面的合体滋养细胞属于终末分化细胞，不再具有增殖和分裂能力，因此不表达P57等细胞周期相关蛋白，可作为P57染色的阴性内对照。对于完全性葡萄胎，细胞滋养细胞和绒毛间质细胞不表达P57，有助于将完全性葡萄胎与表达P57的正常妊娠胎盘、水肿性流产和部分性葡萄胎中区分出来。

尽管P57免疫组化染色已在绝大多数病理科得到了广泛应用，但其对于葡萄胎的诊断仍然具有不可避免的局限性［5］。首先，P57染色无法鉴别部分性葡萄胎和包含有母源性基因的其他水肿性妊娠(如水肿性流产、三体病、双雌三倍体以及胎盘间质细胞发育不良)。其次，即使P57可以用于诊断完全性葡萄胎，但是无法鉴别双精杂合型和单精纯合型完全性葡萄胎，而此两者的生物学行为截然不同，双精杂合型完全性葡萄胎进展为持续性滋养细胞疾病的危险度更高。再次，不完全印迹、人工辅助生殖后的双胎妊娠、罕见的基因嵌合体以及病理医生判读中的主观性偏差都有可能导致P57判读的不确定性而对葡萄胎的诊断造成误差［20］。

3．STR基因分型

STR是人类基因组中长度仅有2～7个核苷酸的DNA重复序列，在基因组非编码区非常丰富并具有高度的遗传稳定性［6］。STR多态性是指个体之间在相应位置的STR位点内重复片段数目有所不同。通过分析多个特异位点STR的数目，可以确认个体的遗传特点而达到个体识别和鉴定的目的。STR多态性分析已经是法医学领域进行个体鉴定最精准的方法。基于同样的原理，分析妊娠组织和相应母体组织的STR多态性，可获得葡萄胎中双亲的遗传成份而有助于明确葡萄胎诊断及分型。使用商品化的STR遗传学分析试剂盒，如 AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification和Promega Powerplex 16HS，能够在一个多重PCR扩增反应中同时扩增15个STR位点及一个性别识别位点，成为一个极其强大的基因组STR多态性分析平台［21］。同时，STR分析所需的DNA模板量极其微小 (少到1.5～2.5ng，相当于150～250个人体细胞)，其扩增片段较短，仅为100～350个碱基对，非常适合分析从福尔马林固定、石蜡包埋组织中提取的DNA样本，其准确性已经分别在法医学领域的身份鉴定和临床移植镶嵌体的检测中得到了很好的验证。

葡萄胎的遗传学背景是其异常的父源性染色体成分。尽管已知很久，直到最近这样的“金标准”才能够用于葡萄胎的常规诊断。因为STR基因分型可以测定同一物种不同成员之间的遗传学差异，所以可鉴定葡萄胎中每一个单倍体基因组是来自于父亲还是来自于母亲。因此，随着商品化STR遗传学分析检测试剂盒的出现和多重STR分析方法性价比的提高，STR基因分型已被公认为是一种准确的和高性价比的葡萄胎诊断和分类的检测方法。

葡萄胎妊娠的STR基因分型需要对绒毛和母体组织 (如子宫内膜)的STR图谱进行对比［22］。鉴别每个STR基因座中有无父源性等位基因以及它的拷贝数是得到准确分析结果的关键，即通过比较每一个STR位点的等位基因，识别出绒毛组织中异常的父源等位基因。如果绒毛组织的STR图谱至少在两个位点全部为父源性等位基因，即为完全性葡萄胎。如果在每个STR位点均出现两个父源性和一个母源性等位基因，即为部分性葡萄胎［23］。具有来自于双亲的平衡性双等位基因表型 (即“一父一母”)属于非葡萄胎妊娠 (二倍体水肿性流产)。而在平衡性双等位基因表型基础上，如在某一个STR位点出现了额外的母源性等位基因，则符合三体病的诊断。

极其少见的双亲源性 (单精单卵)完全性葡萄胎是葡萄胎STR基因检测面临的一个潜在陷阱。尽管有母源性染色体的存在，异常的基因印迹使其组织学表现与完全性葡萄胎非常近似。但由于此种葡萄胎同时具有父源和母源性染色体，STR基因分型显示为平衡性双等位基因表型。此时，P57免疫组化检测常常提示母源性基因的异常印迹 (即细胞滋养细胞和绒毛间质细胞无P57的核表达)，结合患者病史、临床表现和进一步的遗传性突变检测有助于此类罕见遗传性疾病的确诊［5］。发生于双胎妊娠的葡萄胎、基因嵌合体等可能使STR的分析变得复杂，产生难以解读的结果，此时STR基因分型仅可排除葡萄胎，但无法进一步解读上述复杂的遗传学改变［6］。

完整的葡萄胎STR基因型分析流程包括靶组织的选择与分离、DNA提取、STR位点多重PCR、毛细管电泳片段分析以及数据解析与判读。由于绒毛和母体组织的STR多态对比分析是诊断葡萄胎的关键，组织分离和纯化就显得非常重要，尤其是部分性葡萄胎的诊断。在大多数流产刮宫样本中，绒毛和蜕膜组织的界限比较清楚，可轻易辨识而分别装入试管进入提取过程。但一些标本中母体血液、子宫内膜组织或细胞可能会与绒毛组织密切混合，所以评估组织交叉污染的程度是STR基因多态性分析的前提。对于希望用于STR分析的绒毛样本，建议使用生理盐水漂浮的方法做好绒毛和蜕膜的前期分离，病理取材医生将两种组织分别包埋制片，最后由诊断医生进行显微镜下进行确认和精确分离。如前期处理不当或使用存档蜡块，导致不能获得纯净的蜕膜组织，建议使用母体外周血中的白细胞作为母体基因组的来源，用于判断绒毛组织中是否存在过量的父源性基因。

三、展望

随着血清hCG监测和早期超声检查的飞速发展，尽管大多数葡萄胎往往在妊娠的极早期阶段即被终止，但是继葡萄胎之后发生妊娠滋养细胞肿瘤的危险性并未发生改变，而且不同基因型的葡萄胎继发持续性滋养细胞疾病的危险度也有所不同。因此，葡萄胎的精准诊断和分型对于患者的临床处置和预后具有重要意义。目前，单纯形态学诊断的准确性明显不足，病理学家，甚至是妇产科病理学专家在诊断葡萄胎存在着相当的不一致性。如果病理医生对水肿性绒毛组织有诊断疑问，则应该进行包括STR基因分型和/或免疫组化在内的辅助诊断以排除葡萄胎妊娠。STR基因分型为葡萄胎的准确诊断和遗传学分型提供了一种极其有效的分子手段，该方法比传统的流式倍体分析和免疫组化染色具有更大的优越性。随着大多数医院病理科分子诊断能力的逐步提高，STR基因分型将成为葡萄胎常规诊断中必不可缺少的一项应用技术。

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