干旱胁迫诱发的玉米DNA甲基化变异的研究

于晓明 王霞 党晓宇

摘要：本实验以玉米品种B73和H99为实验材料，分别对其进行干旱胁迫处理（0天、5天、7天、9天、11天），用MSAP方法分析干旱胁迫条件下的玉米基因组DNA甲基化变化情况。结果表明，干旱胁迫下，玉米DNA甲基化修饰发生了明显的改变，包括甲基化水平变化和模式变化； B73与H99的甲基化变异程度存在差异，其中B73在处理7天时检测到的变异率最高，为32.48%，H99在处理9天后的变异率最高，为30.00%。本研究初步分析了玉米在干旱胁迫下所发生的表观遗传学变异的频率及其与玉米抗逆性之间可能存在的关系，为进一步研究植物抗干旱胁迫的机制和培育抗干旱玉米新品种提供理论依据。

关键词：玉米；干旱胁迫；DNA甲基化；MSAP

基金项目： 吉林省科技发展计划项目（20130522062JH）；吉林省教育厅科学技术研究项目（吉教科合字[2012]第475号）

中图分类号： S513；Q945.78 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.16.021

1干旱对玉米DNA的影响

我国幅员辽阔，江河湖泊众多，水资源从总量上讲是较丰沛的。但是，由于我国人口基数大，人均淡水量仅为世界平均水平的28.1%，位于世界第88位[1]。我国耕地主要分布于华北、东北、华东和中南4个区域，这4个区域的土地占全国土地面积的43.5%，但耕地面积却占71.7%；西南、西北2个区域的耕地仅占全国耕地面积的28.3%[1]。近些年来，环境恶化、自然灾害严重、雨水资源分布不均、耕地面积缩减，都对我国粮食安全产生造成严重威胁。玉米是各种农作物中能量贮藏最多的种类之一，因而玉米是重要的粮食、饲料以及能量来源。中国的玉米的种植总面积和总产量均居世界第二，未来气候对我国的玉米产量造成严重影响[2]。因此，玉米的单位产量及总产量持续提高对我国粮食安全有重大意义。据有关数据显示，世界上干旱和半干旱地区占陆地面积的比例达到34.9%，我国干旱及半干旱地区占国土面积的比例高达52%，每年受旱面积达200～270余万亩。

DNA甲基化（DNA methylation）是指由DNA甲基转移酶作为催化剂，在S-腺普甲硫氨酸提供甲基供体的基础上完成催化反应，产生出具有甲基的N-甲基腺嘌呤、N-甲基胞嘧啶和C一甲基胞嘧啶[3]。在真核生物中，DNA甲基化主要以5-甲基胞嘧啶的形式存在[4]。根据已有报道显示，多种因素可以诱导嘧啶的甲基化。例如植物的转基因方法能够导致其本身及基因组中同源序列出现甲基化，从而产生基因沉默现象[5]；植物组织离体培养也能诱导甲基化变异的出现，这种现象是体细胞克隆发生变异的主要原因[6]；在哺乳动物中进行种间杂交和水稻不同品系间杂交均可产生大量胞嘧啶甲基化[7，8]。

虽然通过对模式生物尤其是对拟南芥的研究， 已经初步探明植物DNA甲基化产生和维持的机制以及在模式生物生命活动中的生物学功能[9]， 但是目前对DNA甲基化对农作物的影响研究还不够深入[10]。本实验通过对玉米进行干旱处理，研究干旱与DNA甲基化之间的联系，从而为利用DNA甲基化多态性进行作物改良或去除胁迫印迹来提高作物的抗逆性提供理论基础，对提高玉米产量具有重要意义。

2 材料与方法

2.1 试验材料

玉米品种B73和H99，经不同时间（0天、5天、7天、9天、11天）的250mM甘露醇（干旱）胁迫处理。

2.2 试验方法

2.2.1 玉米干重测量 在玉米发芽15天后（V3期），分别称取正常条件下和经5天、7天、9天、11天干旱处理过（250 mM甘露醇模拟干旱胁迫）的玉米全株各20株，干燥箱烘干至恒重，称量干重。

2.2.2 玉米DNA甲基化敏感扩增多态性（MSAP）分析 提取玉米基因组DNA，进行MSAP分析，包括：限制性酶切、连接、预扩增和选择性扩增（MSAP实验方法与体系主要参照罗洋的研究[11]）。选择性扩增产物送交长春华大中天生物技术有限公司进行毛细管电泳和荧光信号读取。统计MSAP扩增条带，信号值大于80时认为有条带记录为1，小于80时认为没有条带记录为0。

3 结果分析与讨论

3.1 玉米干重分析

如图1所示，B73和H99在干旱胁迫处理后，干重显著下降。而且H99干重下降的程度比B73更大。B73干旱胁迫处理5天、7天、9天、11天后的干重分别为0.715、0.663、0.617、0.283；H99干旱胁迫处理5天、7天、9天、11天后的干重分别为0.846、0.756、0.676、0.400。干旱胁迫处理11天时B73和H99均降为最低。表明B73对干旱胁迫比H99更耐受。

图1 玉米H99和B73干旱处理后的干重

3.2 干旱诱导的玉米DNA甲基化水平变异

如图2所示，通过对扩增条带的统计并比较，可以发现B73和H99在干旱胁迫处理后DNA甲基化情况都发生了明显的变化。其中，B73正常条件下的CG甲基化水平为15.33%，干旱胁迫处理后CG甲基化水平呈略微下降趋势；而H99与之相反，正常条件下CG甲基化水平为11.42%，干旱胁迫处理后CG甲基化水平呈略微上升趋势。B73正常条件下CHG甲基化水平为16.27%，干旱处理后CHG甲基化水平呈先下降后在第11天时明显上升；H99则是先下降后呈略微上升趋势。上述结果表明，两个玉米品种B73和H99的在应答干旱胁迫过程中甲基化水平都发生了改变，但是二者甲基化水平变化的方式各不相同，暗示着不同玉米基因型中的甲基化背景对玉米应答干旱胁迫中的甲基化水平变化是有影响的。

图2 甲基化整体水平变异情况

注：B73-1，B73-2，B73-3，B73-4，B73-5分别为B73干旱处理0天，5天，7天，9天，11天；

H99-1，H99-2，H99-3，H99-4，H99-5分别为H99干旱处理0天，5天，7天，9天，11天。

3.3 DNA甲基化模式变异条带统计分析

根据MSAP分析条带表明，B73和H99经干旱处理后的CG和CHG位点均发生了DNA甲基化模式的变异，且二者的甲基化模式变异频率存在差异。B73处理中B73-2的DNA甲基化条带数为973，占总甲基化的29.48%；B73-3的甲基化条带数为1072，占32.48%；B73-4甲基化条带数为915，占27.73%；B73-5甲基化条带数为1015，占30.76%。H99处理中H99-2甲基化条带数为826，占总甲基化的25.03%；H99-3甲基化条带数为838，占25.39%；H99-4甲基化条带数为990，占30.00%；H99-5甲基化条带数为863，占26.15%。

如图3所示，B73的干旱处理中5天、7天、9天主要以CG去甲基化变异为主，而处理11天时的CG和CHG位点的去甲基化和超甲基化模式变异率相差不大。H99各个处理主要以CHG去甲基化变异为主，且变异率成递增趋势。B73在处理7天时的甲基化模式变异率最高32.48%，而H99是在处理9天时的甲基化模式变异率最高30.00%。B73干旱处理后CG超甲基化呈先上升后下降趋势，CHG去甲基化呈下降趋势，但CG去甲基化和CHG超甲基化变化无规律；H99的CHG超甲基化呈先上升后下降趋势，CHG去甲基化成上升趋势，但CG吵架计划和去甲基化无规律；B73和H99的both超甲基化和both去甲基化基本无变化。

图3 甲基化模式变异情况

注：CG hyper：CG超甲基化，CG hypo：CG去甲基化，CHG hyper：CHG超甲基化，CHG hypo：CHG去甲基化，both hyper：both超甲基化，both hypo：both超甲基化。

3.4 讨论

逆境胁迫下会导影响基因的表达，进而大致DNA甲基化的变化。本实验通过MSAP分析方法对比两种不同品种玉米的DNA甲基化变异情况，发现干旱胁迫下两种玉米均发生了不同程度的甲基化变异。两种玉米的CG和CHG位点同时甲基化程度变异基本无变化。在甲基化模式变异中，B73的CG超甲基化呈先上升后下降趋势，CHG去甲基化呈逐渐降低趋势；H99的CHG超甲基化呈先上升后下降趋势，CHG去甲基化成呈逐渐递增趋势。B73主要以CG位点去甲基化为主，H99主要以CG位点超甲基化和CHG位点去甲基化为主。B73在干旱处理7天时CG去甲基化和超甲基化程度均达到最高分别为10.09%和6.91%，CHG去甲基化程度随着干旱处理时间的增加而降低。H99的CHG去甲基化程度在逐渐升高，CG位点甲基化升降趋势不同。B73在处理7天后的甲基化模式变异率最高32.48%，而H99是在处理9天后的甲基化模式变异率最高30.00%。但这些变化导致了哪个基因或是哪些基因的表达，影响了基因表达过程中的哪一步还不清楚，还需进一步研究。

参考文献

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[7]O'Neill R J， O'Neill M J， Granes J A M. Undennethyla

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[9]宋欣欣. 低氮水平下诱导的水稻DNA甲基化变异[D]. 长春：东北师范大学， 2009.

[10]杨美娜， 杨瑰丽， 郭涛. 逆境胁迫下植物DNA甲基化及其在抗旱育种中的研究进展[J]. 中国农学通报， 2013， 29（06）：6-11.

[11]罗洋. 肥料和密度对玉米生长发育及DNA甲基化的影响[D]. 哈尔滨：东北农业大学， 2014.

通讯作者：于晓明，吉林农业科技学院，讲师，研究方向：分子生物学与基因工程。