ApoE基因敲除小鼠海马CA3区神经元形态学和微管相关蛋白2表达变化

季 丹，黄大可，桂 丽，贾雪梅



ApoE基因敲除小鼠海马CA3区神经元形态学和微管相关蛋白2表达变化

季 丹1,2，黄大可3，桂 丽3，贾雪梅1

目的 观察载脂蛋白E基因敲除(ApoE KO)对小鼠海马CA3区神经元形态结构改变以及微管相关蛋白2(MAP-2)表达的影响。方法 10只野生型C57BL/6J小鼠为对照组，10只ApoE基因敲除小鼠为KO组，普通饲料喂养3个月。采用分光光度计检测血脂变化；取两组小鼠脑组织，HE染色和电镜技术观察海马CA3区结构改变，免疫组织化学技术观察两组小鼠海马CA3区MAP-2表达变化, 采用计算机图像分析系统检测其平均光密度(MOD)值。结果 与对照组比较，KO组小鼠血浆总胆固醇、血浆三酰甘油、低密度脂蛋白含量明显升高(P<0.05，P<0.01)。光镜下，KO组小鼠海马CA3区锥体细胞较小，排列稀疏松散。电镜下，KO组海马神经元内线粒体肿胀变性，嵴消失；神经纤维髓鞘松懈；突触小泡数量减少，突触间隙模糊等。免疫组织化学结果显示，对照组小鼠海马神经元内MAP-2高表达， KO组含量明显减少；图像分析显示KO组CA3区MAP-2 MOD值明显降低(P<0.05)。结论 ApoE KO小鼠海马神经元结构出现病理改变，MAP-2表达下降，提示ApoE KO与神经退行性病变有一定联系。

载脂蛋白E基因敲除；微管相关蛋白2；超微结构；海马CA3区；小鼠

载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是一种转运血脂的血浆蛋白，参与调节机体脂质代谢和胆固醇平衡[1]。在神经系统中，ApoE参与胆固醇及磷脂的动员和再分布，可调节突触可塑性和修复神经元损伤，是目前已知的唯一与神经系统密切关联的载脂蛋白，也是第一个被确认的散发型和迟发家族型阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的重要易感基因[2]。近年来，胆固醇代谢异常、ApoE 对胆固醇代谢的调节等已越来越多地被证实与AD的发生和发展密不可分。本课题组前期研究[3]表明， ApoE基因敲除(ApoE gene knockout，ApoE KO)小鼠会引起海马神经元中β淀粉样蛋白(amyloid protein β，Aβ)的沉积，可能会引起AD等神经退行性疾病的认知功能障碍。研究[4]显示，作为一种新型动物模型——ApoE基因敲除小鼠，已应用于认知障碍和记忆关系的研究。AD确切发病机制目前尚不明确，有研究者认为，细胞骨架的异常装配和信号传递的障碍可引发AD等神经退行性疾病[5]。微管相关蛋白-2(microtubule-associated proteins-2，MAP-2)是构建细胞骨架的结构性微管相关蛋白家族，可促进微管形成、维持微管稳定、诱导微管成束，参与神经元发育、突起的形成和生长以及信息传导等过程[6]。海马CA3区是与记忆相关情报储存的关键部位，该研究通过外购ApoE基因敲除小鼠，对海马神经元CA3区进行超微结构及MAP-2表达观察，旨在为进一步探讨 ApoE异常引发AD等神经退行性疾病的可能机制提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备 20只清洁级野生型C57BL/6J小鼠购自中国协和医科大学，其中10只作为对照组，另10只为ApoE基因敲除小鼠作为KO组，单笼饲养12周，此期间各组动物均不限制饮食和饮水。普通饮食喂养3个月，禁食12 h后，将两组小鼠水合氯醛麻醉下行下腔静脉采血，离心后取血清，-20 ℃保存，待测血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)水平。取脑组织，用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片(厚4 μm，矢状面切片)，待后续实验。

1.2 主要试剂 兔抗鼠MAP-2单克隆抗体购自美国Sigma公司，SP免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。常用生化试剂：LDL试剂盒、TC试剂盒、TG试剂盒等均购自南京建成生物工程研究所，严格按照试剂盒说明书，采用分光光度计检测。

1.3 HE染色 石蜡切片脱蜡至水，入苏木精染色10 min，再进行盐酸乙醇分色、蓝化，入伊红染色1 min，脱水、透明、封片，显微镜观察并摄片。

1.4 电镜观察 将两组小鼠新鲜海马组织预固定于4%戊二醛，1%锇酸后固定，梯度乙醇脱水，常规Epon-812 包埋、定位，60 nm超薄切片，醋酸铀及柠檬酸铅双重染色，置日产JEO L-1230透射电镜下观察并摄片。

1.5 免疫组织化学染色 采用免疫组织化学SP法染色，按照试剂盒说明书进行。3%过氧化氢溶液处理，微波中火抗原修复，山羊血清封闭，滴加兔抗鼠MAP-2抗体(稀释度为1 ∶100)，37 ℃孵育30 min后，置4 ℃过夜；二抗为生物素化羊抗兔IgG血清，37 ℃孵育30 min；辣根酶标记链酶卵白素工作液37 ℃孵育30 min。DAB显色，脱水、透明、封片。用PBS替代一抗作阴性对照。

1.6 计算机图像分析 采用南京大学捷达公司801计算机病理图象分析系统，应用日本Nikon Eclipse-800i显微镜，随机选取20倍物镜下6个视野，计算海马CA3区神经元内MAP-2阳性染色平均光密度(mean optical density，MOD)值。

2 结果

2.1 血清血脂生化指标检测结果 与对照组比较，KO组血清TC、TG、LDL水平明显升高(P<0.05，P<0.01)，见表1。

表1 两组小鼠血清脂质生化指标比较±s)

2.2 HE染色检查结果 HE染色后在光镜下显示，海马由CA1～CA4区域组成，可分为分子层、锥体细胞层和多形细胞层。对照组海马CA3区锥体细胞层的神经元排列紧密，胞体呈锥体形，神经元的细胞核大而圆，着色浅。KO组小鼠海马CA3区锥体细胞排列紊乱、松散，胞体较小，见图1。

2.3 电镜观察结果 电镜下显示，对照组海马CA3区锥体细胞胞质丰富，内含较多游离核糖体、线粒体成分； KO组海马神经元内线粒体肿胀变性，嵴断裂，粗面型内质网扩张，见图2。对照组神经纤维髓鞘结构完整，密度均匀一致；KO组神经纤维髓鞘结构不完整、松懈，密度较对照组降低，见图3。对照组突触结构完整，突触前成分中有大量突触小泡，突触间隙清晰，突触后膜特化增厚；KO组神经末梢可见突触结构小泡明显减少，突触间隙模糊，见图4。

图1 小鼠海马CA3区神经元 HE×200

图2 小鼠海马CA3区神经元超微结构 电镜×15 000

图3 小鼠海马CA3区神经纤维超微结构 电镜×25 000

2.4 MAP-2免疫组化染色结果 本研究阳性染色结果为细胞质中出现明显的黄色或棕黄色颗粒。在对照组中，MAP-2黄褐色阳性产物主要表达在海马神经元胞质和树突内，且阳性染色显示的黄色颗粒样物质表达较高，神经元突起较为光滑，呈连续而纤细的条索状。KO组含量较少，MAP-2 免疫阳性产物在胞体和树突中较对照组明显减少，条索状阳性产物连续性不完整。阴性对照结果呈阴性，见图5。

图4 小鼠海马CA3区神经突触超微结构 电镜×50 000

图5 小鼠海马CA3区神经元MAP-2表达 SP法×400

2.5 计算机图像分析海马CA3区MAP-2表达 与对照组比较，KO组小鼠海马CA3区神经元内MAP-2 MOD值明显降低，差异有统计学意义(0.489±0.065vs0.339±0.029，t=2.659，P<0.05)。

3 讨论

ApoE主要分布于乳糜微粒(chylomieron，CM)、LDL中，是机体LDL受体的配体，在脂蛋白代谢中作用显著[1]。基因敲除ApoE的小鼠因清除脂质障碍，易在短期内形成高脂血症[2]。本研究结果证实，与对照组比较，ApoE基因敲除3个月后，KO组小鼠血清中TC、TG、LDL水平显著升高，说明KO组小鼠已存在严重脂蛋白代谢障碍，模型建立成功。血浆蛋白ApoE与血脂转运相关，在神经损伤的再生、神经元轴突的延伸中起一定的作用[1]。本课题组前期研究[3]表明，ApoE可调控大脑中Aβ的沉积和降解，Aβ与机体的学习、记忆、信息存储等功能关系密切，海马区Aβ的沉积受累，是引起AD的重要原因。文献[7-8]报道，ApoE基因敲除可致Aβ沉积，可能与AD认知功能障碍有关。MAP-2是正常脑组织的神经元胞质中含量最丰富的细胞骨架蛋白，具有调节微管稳定性作用，作为神经元突起的可塑性的调节蛋白发挥作用。研究[5]表明，细胞骨架的异常装配和信号传递的障碍亦可引发AD等神经退行性疾病。

大脑海马区兴奋阈值低，海马CA3区神经元数量多，功能重要，探讨海马CA3区锥体神经元的形态发育对阐明AD发病机制具有非常重要的意义[9]。本实验形态学结果证实，KO组较对照组CA3区锥体细胞排列紊乱、松散。电镜下，KO组海马神经元内线粒体肿胀变性，嵴断裂，粗面型内质网扩张；神经纤维髓鞘结构松懈，密度下降；突触小泡数量显著减少，突触间隙模糊。电镜结果提示，KO组小鼠学习记忆的海马CA3区神经元、神经纤维、突触均发生变化，这些可能是ApoE基因敲除小鼠产生学习记忆功能障碍的原因之一。MAP-2属于热稳定的磷蛋白，在神经元的胞体及树突内分布广泛，调节神经元的生长、轴突和树突的形成以及突触可塑性[5,9]。本研究中免疫组化结果显示KO组小鼠海马CA3区神经元中MAP-2的表达明显下降。 分析其下降的可能机制有[8-10]：① ApoE基因敲除后，小鼠海马CA3区结构改变，锥体细胞线粒体结构不可逆性损伤，致使细胞能量代谢障碍；② 锥体细胞粗面型内质网扩张，细胞蛋白质的合成能力削弱；③ ApoE 基因敲除后，引起第二信使系统、谷氨酸受体亚单位和蛋白激酶受损，使得MAP-2表达下降，神经纤维修复障碍，并进一步引发加重AD等神经退行性疾病的发生发展。在神经细胞发育过程中，MAP-2可以调节微管聚合和稳定性，对神经元突起的发生、延长和稳定发挥着重要作用，微管结构蛋白MAP-2的下降，减弱了神经纤维轴突和树突的产生和突触的重建；MAP-2表达下降，加重了微管的不稳定性，其聚合作用下降，影响细胞有丝分裂和细胞骨架的正常装配，这些变化有可能导致AD病变的发生[10]。但是，MAP-2 表达在ApoE 基因敲除小鼠海马CA3 区神经元的分子机制，以及其与神经元损伤恢复与行为能力的改变有何内在联系，有无AD特征性的病理改变如神经纤维缠结等尚需进一步研究。

综上所述，本实验通过ApoE基因敲除小鼠，证实其存在脂蛋白代谢障碍。ApoE 基因敲除小鼠海马CA3区神经元超微结构明显变化，这种改变可能与MAP-2 表达下降有关。

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Neuronal morphology and microtubule associated protein 2 expression changes in ApoE knockout mice hippocampal CA3 area

Ji Dan1,2，Huang Dake3，Gui Li3，et al

(1DeptofHistologyandEmbryology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032；2CollegeofBasicMedicine,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230061；3ComprehensiveLaboratory,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032)

ObjectiveTo observe the effect of apolipoprotein E knockout (ApoE KO) on structural changes in neuronal morphology of hippocampal CA3 area of mice and microtubule-associated protein 2 (MAP-2) expression.Methods10 normally-fed C57BL/6J wild mice were chosen as the control group, and 10 gene knockout mice were selected as ApoE KO group fed with a common diet for 3 months. Blood lipid changes were detected by spectrophotometer testing. Brain tissues of the two groups of mice were taken out to observe structural changes in hippocampal CA3 area by HE staining and electron microscopy techniques. MAP-2 protein expression changes in hippocampal CA3 area were observed by immunohistochemical technique. Average optical density (MOD) expression changes were analyzed by computer image system.ResultsCompared with the control group, plasma total cholesterol, triglyceride and low density lipoprotein cholesterol levels of the KO group were significantly higher (P<0.05,P<0.01). Light microscope showed that hippocampal CA3 pyramidal cells of KO group mice were smaller, sparsely and loosely arranged. Under the electron microscope, hippocampal neurons mitochondria of KO group swelled and degenerated and ridge disappeared, myelin sheath of nerve fibers relaxed, the number of synaptic vesicles decreased and synaptic cleft obscured. Immunohistochemical results indicated that the MAP-2 in hippocampal neuron was higher in the control group, whereas that of KO group was remarkably diminishing; image analysis showed that MAP-2 OD value in CA3 area of KO group significantly decreased (P<0.05).ConclusionApoE KO may contribute to pathological changes of hippocampal neuron structure of mice and decrease MAP-2 expression, which signifies that ApoE KO is correlated with neurodegenerative disorders.

apolipoprotein E gene knockout; microtubule associated protein 2; ultra microstructure; hippocampal CA3 area; mice

安徽高校省级自然科学研究项目(编号：KJ2012A164)

1安徽医科大学组织学与胚胎学教研室，合肥 2300322安徽医学高等专科学校基础部，合肥 2300613安徽医科大学综合实验室，合肥 230032

季 丹，女，讲师，硕士研究生； 贾雪梅，女，教授，硕士生导师，责任作者， E-mail：jiaxueme@126.com

时间：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.010.html

R-332

A

1000-1492(2016)11-1600-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.010

2016-07-06接收