双水相萃取-LC-MS/MS同时测定环境水中11种抗生素

王 敏，李 波，刘 超，张 祥，赵 艳，李晓通，马丽梅，侯师成，殷军港

(1 烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264000；2 山东省诸城市检验检测中心，山东 诸城 262200)



双水相萃取-LC-MS/MS同时测定环境水中11种抗生素

王 敏，李 波，刘 超，张 祥，赵 艳，李晓通，马丽梅，侯师成，殷军港

(1 烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264000；2 山东省诸城市检验检测中心，山东 诸城 262200)

建立了采用乙腈/磷酸氢二钾双水相体系对环境水中的痕量抗生素进行富集、净化后进行LC-MS/MS分析的检测方法。质谱分析采用电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描、多反应监测(MRM)模式，检测时间在12 min。方法的线性关系良好，方法检出限为0.2～2.3 ng/L。11种抗生素的样品加标回收率为80%～120%，相对标准偏差均小于10%。在山东省内三个地区采样分析，有6种抗生素被检测出，浓度在0.9～3.9 ng/L之间，证明本分析方法的应用性良好。

LC-MS/MS；环境水；双水相萃取；抗生素

自1929年英国细菌学家弗莱明发现了青霉素后，抗生素便大规模的用于抗菌等的临床使用中。据调查，我国抗生素的生产量和使用量与西方国家相比普遍较高[1-3]，并且有数据表明我国抗生素滥用的问题比较严重[4]。由于人畜服用的抗生素大多不能被充分吸收，未被吸收的抗生素随排泄物进入到环境水中，有研究[2]指出中国地表水环境中能检测到六类共68种抗生素。比如磺胺类药物在珠江[5]、辽河[6]、海河[7]等流域的检出率达100%，而在美国和日本几乎均为未检出或检出的浓度很低[8-9]。与其他国家相比，我国地表水中抗生素的检出频率和种类较多。目前，我国也已经出台了关于排放的废水中抗生素限量标准。抗生素滥用所带来的极大危害[10]，迫切要求开发一种快速准确的抗生素检测技术来监测环境水中的抗生素含量。

近年来的抗生素的检测方式由传统的微生物法[11]逐渐转为高效的仪器检测，如高效液相色谱(HPLC)检测[12-14]。但在使用HPLC同时检测多种抗生素时，定性比较困难。国外比较新兴的是使用高效液相色谱串联质谱(Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS/MS)对多种抗生素同时定性定量[15-17]，效率高且准确度好。所以本实验采用的用LC-MS/MS对环境水中的抗生素进行同时检测。环境水中的抗生素的含量比较低且杂质含量较高，一般都需要采集较大的样品体积经过前处理(净化、富集、浓缩、复溶)后再进样检测。近年来使用比较多的前处理方式是固相萃取[16, 18]，但是固相萃取具有耗时长、溶剂浪费严重等缺点。

双水相萃取(Aqueous Two-Phase Extraction，ATPE)技术则比较好的解决了这些问题，富集、净化、浓缩一步完成，耗时短，分析效率高。最近几年的研究显示，某些亲水性的有机溶剂如乙腈[19-20]、异丙醇[21-22]、丙酮[23]与合适的无机盐、水混合形成的低分子有机物双水相体系可以快速的实现物质的转移和相的分离，已经成功的应用到金属离子[22]的萃取和分离中。而低分子有机物双水相体系对于萃取抗生素的研究还比较少[24]，以双水相萃取作为前处理方法，结合LC-MS/MS检测抗生素的研究则更少。本实验根据抗生素在双水相体系形成的两相中分配系数的不同，抗生素被提取到有机物含量较高的上相，萃取、净化和浓缩同时完成。与固相萃取等传统萃取方式相比，在保证准确度的同时，可以极大的提高萃取效率。

本研究共检测了5类共11种生产量均排在我国抗生素生产总量前列[10]的抗生素(四环素(Tetracycline Copharlan，TC)、土霉素(Oxytetracycline，OTC)、强力霉素(Doxycyclme，DC)、金霉素(Aureomycin Chlortetracycline，CTC)、阿莫西林(Amoxicillin，AMO)、青霉素V(Penicillin V，PEN)、依诺沙星(Enoxacin，ENO)、诺氟沙星(Nofloxacin，NOR)、头孢呋辛(Cefuroxime，CXM)、罗红霉素(Roxithromycin，ROX)、克拉霉素(Clarithromycin，CLA))，首次运用低分子有机物/盐双水相萃取(ATPE)对水样中抗生素进行富集净化，建立了使用LC-MS/MS同时检测水中5类11种抗生素的分析方法。两者的结合使得检出限大大的降低，检测时间也极大的缩短。方法具有选择性强、灵敏度高等优点，同时处理与同时检测极大的提高了实验效率，为建立抗生素检测的相关法规提供参考。本研究共取潍坊市、烟台市和枣庄市三个地区的水样进行实际分析，效果良好。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

API4000 LC-MS/MS，美国ABSCIEX公司；QL-861涡旋混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；HGC-24A氮吹仪，天津恒奥公司；pH计，美国HANNA公司。

乙腈和甲醇(色谱纯)、甲酸(纯度为98%)、乙酸铵(纯度为99%)均购自德国默克公司；氨水、磷酸氢二钾(K2HPO4)(分析纯)，购自国药集团化学试剂有限公司。

头孢曲松(CXM)、青霉素V(PEN V)、依诺沙星(ENO)、诺氟沙星(NOR)、罗红霉素(ROX)、克拉霉素(CLA)、四环素(TC)、盐酸土霉素(OTC)、强力霉素(DC)、金霉素(CTC)、阿莫西林(AMO)均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司(Augsburg，Germany)，纯度均在98%以上。

标准储备液和标准工作液的配制：分别称取10 mg标准品，用甲醇定容到10 mL容量瓶中，配成1 mg/mL的标准储备液，于冰箱中-20 ℃避光保存备用。取适量标准储备液，用流动相配成所需要的标准工作液，于4 ℃保存备用。

1.2 仪器条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Venusil ASB C18柱(150 A×2.1 mm×100 mm)；流动相A：水+0.1%甲酸；流动相B：甲醇；流速：0.4 mL/min；进样量：8 μL；梯度洗脱条件：0～2 min：95% A；2.5～4.5 min：85% A；5～7 min： 75% A；7.5～9.5 min：55%A；10～12 min：45%A；12.5～14 min：95%A。

1.2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)，以正离子扫描在多反应监测(MRM)模式下进行分析。使用针泵进样，进行母离子(Q1)和子离子(Q3)的扫描，进而进行去簇电压(DP)、锥孔电压(CE)等参数的优化(见表1)。在选定的色谱条件下，对质谱参数进行优化，以达到较高的灵敏度。优化后的质谱分析条件为：离子源温度：450 ℃；喷雾电压(IS)：5000.0 V；雾化气(GS1)：45 psi；辅助气(GS2)：50 psi；碰撞气(CAD)：4 psi；气帘气(CUR)：25 psi。

表1 11种抗生素的质谱条件

*定量离子。

1.3 样品前处理方法

本研究使用乙腈/磷酸氢二钾双水相体系对水样进行前处理。在25 ℃环境温度下，取10 mL过0.22 μm滤膜的水样置于50 mL的离心管中，分别加入15 mL乙腈和7.14 g磷酸氢二钾。涡旋震荡5 min，以9000 r/min的转速离心8 min，取出后静置，出现稳定的分层现象后，将上相的液体取到另外的干燥离心管中，以60 ℃氮气吹干后，用1 mL甲醇复溶，上机检测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

实验考察了Kromasil 5u C18(150 A×4.6 mm×250 mm)和Venusil ASB C18柱(150 A×2.1 mm×100 mm)两种色谱柱对11种抗生素的分离效率，发现两种色谱柱均能将11种抗生素分离，但在使用Venusil ASB C18柱时分离时间较短，因此从效率的角度来说，使用Venusil ASB C18柱(150 A×2.1 mm×100 mm)色谱柱。

当固定相(C18柱)确定时，不同流动相对于抗生素的洗脱效果是不同的。当流动相A为水时，本实验分别考察了甲醇、甲醇-乙腈(1:1，V/V)、乙腈作为流动相B对于11种抗生素洗脱分离的影响。当使用甲醇作为流动相时，可以将抗生素全部洗脱，且峰型较好，则选择甲醇作为流动相B。

除此之外，流动相的pH值对于抗生素的分离和保留也具有重要的影响。本实验考察了当pH值分别为3.0、6.0、12.0时，洗脱效果的变化。当pH值为3.0或6.0时，洗脱效果比较好，且pH值3.0时的峰型比较平滑。但当pH值为12.0时，只出现四环素类抗生素的峰，且峰型较差。原因可能是由于甲酸提供的H+有利于化合物的离子化，可以得到较高的检测灵敏度。

图1 11种抗生素标准混合溶液在最佳条件下的色谱图

综上，本文最终选用的是甲醇和甲酸水(pH值为3.0)作为流动相，经过各种考察最终确定了1.2.1中的梯度洗脱条件。图1为最佳条件下的11种抗生素标准溶液的色谱图。

2.2 双水相体系同时萃取11种抗生素最佳萃取条件的优化

本研究选择乙腈/磷酸氢二钾双水相体系作为环境水样的前处理体系，考察本双水相体系同时萃取11种抗生素时的最佳萃取条件。将双水相体系的总质量控制为10 g，考察分别在不同的乙腈和无机盐的质量分数下11种抗生素萃取率的变化情况。由图2可知，当乙腈与磷酸氢二钾的质量分数之比为1.6时(即乙腈的质量分数为40%，磷酸氢二钾的质量分数为25%时)11种抗生素的萃取率比较高。

保持乙腈和磷酸氢二钾的质量分数不变，考察双水相体系pH和温度的变化对萃取率的影响。但实验现象表明，当pH降低或当温度低于20 ℃时均有盐析出，且随着温度的变化萃取率的变化并不明显，故不做讨论，以自然pH与室温作为实验条件。

图2 不同的腈与无机盐质量分数时11种抗生素的萃取率

2.3 方法学验证

2.3.1 线性范围、检出限、定量限

在优化后的液相和质谱条件下，对一系列浓度的抗生素标准混合溶液进行检测。以各个抗生素的定量离子对的峰面积进行定量，得到的各个抗生素的线性范围和相关系数(见表2)。由表2可以看出，11种抗生素均有比较宽的检测范围，且在线性范围内线性关系良好，r2均大于0.99。本实验方法的检出限(MDL)和定量限分别低至0.0002～0.0110 μg/L、0.0007～0.0367 μg/L。

表2 11种抗生素的线性范围、线性方程、相关系数、检出限、定量限

2.3.2 精密度和准确度

以枣庄山亭区的某地井水进行加标回收实验，加标水平分别为定量限浓度的0.5倍、1.0倍、2.0倍，经过如1.3中的前处理方法处理后，在优化后的液相和质谱条件下进行分析，每个水平做五个平行实验，计算回收率和相对标准偏差(见表3)。井水中的加标回收率均在80%-120%之间，RSD均小于10%。说明本实验采用的乙腈/磷酸氢二钾双水相萃取作为前处理方法有良好的精密度和准确度。

表3 11种抗生素的精密度和加标回收率

2.4 山东省内三个地区环境水中抗生素含量的分析

取潍坊市潍河水样(1#)、烟台市凤凰山水库水样(2#)和枣庄市山亭区地下水水样(3#)进行实际样品的测量。经过乙腈/磷酸氢二钾双水相体系富集净化后，采用已优化的LC-MS/MS条件，分别对三个水样进行实际测量。每个样品测五个平行，结果见表4。

实验结果表明，在山东省内三个地区(潍坊、烟台、枣庄)所采集的水样中均有不同种类和浓度的抗生素药物残留。抗生素污染问题依旧不可小觑。

表4 山东省内三个地区环境水中抗生素含量的分析结果

ND:未检出。

3 结 论

本实验创新性的使用乙腈/磷酸氢二钾双水相体系对环境水中的痕量抗生素进行富集、净化和浓缩，取上相进行氮吹、复溶后，进行LC-MS/MS分析，建立了环境水中多种抗生素同时检测的分析方法，并显示出较高的灵敏度和选择性。同时检测的分析方法提高了实验室抗生素检测的效率，在实际中应用良好，并为下一步健全抗生素标准的法律法规奠定了基础。

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Simultaneous Determination of 11 Antibiotics in Environmental Water by ATPE-LC-MS/MS

WANGMin1,LIBo2,LIUChao1,ZHANGXiang1,ZHAOYan1,>LIXiao-tong1,MALi-mei1,HOUShi-cheng1,YINJun-gang1

(1 College of Life Sciences, Yantai University, Shandong Yantai 264000; 2 Zhucheng Inspection and Testing Center, Shandong Zhucheng 262200, China)

A method that coupled with aqueous two-phase extraction (ATPE) and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was established for simultaneous determination of 11 antibiotics in environment water. 11 antibiotics were analyzed simultaneously in one analytical run with the same prepared procedure.The same clean-up and enrichment process was carried with dipotassium hydrogen phosphate/acetonitrile aqueous two-phase extraction (ATPE). The measurement was an analysis time of 12 minutes by LC-MS/MS in ESI+ mode. In the following validation process, the limit of detection (LOD) was from 0.006 μg/L to 0.023 μg/L for each analyte. Average recoveries were from 80% to 120% with the relative standard deviation (RSD) less than 10%. The validated method exhibited high sensitivity and precision, and it will ensure the multi-residue analysis at low concentration for the antibiotics in water.In the detection of the real samplesin Shandong, 6 antibiotics were detected, the concentration between 0.9～3.9 ng/L, which showed that the analytical method in the real sample was good.

LC-MS/MS；environmental water; ATPE; antibiotics

烟台大学研究生创新科研基金(项目编号：YDYB1626)。

王敏(1990-)，女，硕士研究生，主要从事仪器分析。

TS207.3,O65,X132

A

1001-9677(2016)022-0073-05