狼疮性肾炎患者外周血树突状细胞功能的研究

谭德敏 向 阳 谭千林

(湖北民族学院附属民大医院,恩施445000)



狼疮性肾炎患者外周血树突状细胞功能的研究

谭德敏 向 阳 谭千林

(湖北民族学院附属民大医院,恩施445000)

目的： 体外培养狼疮性肾炎患者外周血树突状细胞，并从细胞的表型和功能方面观察与对照组树突状细胞的不同，从而探讨树突状细胞在狼疮性肾炎疾病的发病机理。方法：选取50例健康对照者与50例狼疮性肾炎患者，收集狼疮性肾炎患者 及健康对照组的外周血 ，体外给予10 ng/ml GM-CSF及IL-4的血清培养液培养，并在第7天，收集细胞及上清，运用流式细胞技术检测DCs表型表达，ELISA方法检测细胞上清TNF-α、 IL-12含量变化，检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖的能力。结果：与对照组相比，狼疮性肾炎患者外周血树突状细胞表面表达的CD80、CD86、CD40及MHCⅡ数量明显高于对照组，差异存在统计学意义(P<0.05)；树突状细胞分泌的TNF-α、 IL-12明显高于对照组，差异存在统计学意义(P<0.05)；树突状细胞刺激淋巴细胞增值反应能力明显高于对照组，差异存在统计学意义(P<0.05)。结论：相比于健康对照组，狼疮性肾炎患者外周血树突状细胞呈现较成熟的状态，提示树突状细胞与狼疮性肾炎疾病具有很大的相关性。

树突状细胞；狼疮性肾炎；成熟

狼疮性肾炎(Lupus nephritis，LN)是一种多种因素导致的复杂性疾病，其致病机制至今未明，但多种研究认为其与免疫因素密切相关[1]。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)作为机体内最重要的抗原递呈细胞，在机体起着重要作用。成熟的树突状细胞可以高表达多种共刺激因子，如CD86、CD80、CD40、MHCⅡ等，高分泌多种细胞因子，如IL-12、TNF-γ，诱导幼稚的T细胞分化成熟，促进T细胞向Th1/Th2极化，从而激活免疫应答[2-4]。鉴于DCs在免疫系统中的重要作用，我们推测DCs在LN患者的发病机制中起到了重要的作用。因此，本研究提取LN患者的外周血，分离纯化得到DCs，观察DCs的表型和功能的变化，来探讨DCs在LN疾病发生发展的意义。

1 对象与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料 (1)实验组：选取2013年1月到2015年6月在我院肾内科就诊的LN患者50例，其中男性30例，女性20例，年龄为27～64岁，平均(37.9±7.6)岁。纳入标准：①病情符合1982年美国风湿病学会修订的LN诊断标准，并经肾活检病理检查确诊为LN的患者；②患者年龄在75岁以下，心肝功能基本正常。排除标准：①患者自身存在风湿性关节炎、系统性血管炎等其他风湿性免疫性疾病，病毒性肝炎、心梗、糖尿病等影响免疫系统的疾病；②入院前3个月内使用过激素或免疫性药物的患者；③妊娠及哺乳期妇女；④合并有心脑造血系统及精神系统的患者。⑵对照组：选取健康志愿者50例，其中男性28例，女性22例，年龄为26～67，平均(38.2±6.5)岁。纳入标准：①不存在LN的临床症状，并且影像学检查未见异常；②患者年龄在75岁以下，心肝功能基本正常。排除标准同实验组。实验组与对照组在性别、年龄等方面差异不存在统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本调查程序符合本单位的伦理学标准并得到批准，且已得到患者与家属的知情同意。

1.1.2 标本采集 分别收集对照组及实验组在血液标本8 ml，肝素抗凝。

1.2 方法

1.2.1 DCs的分离培养 将血液标本与PBS缓冲液倍比稀释混匀，严格按照说明书进行步骤操作，将混合液轻轻置于淋巴细胞分离液上，4℃，3 000 r/min，离心30 min。轻轻取出离心管，此时会出现分层，将第二层白膜细胞洗出置于另一离心管中，加入PBS清洗，获得单个核细胞备用。配置含有10%胎牛血清的1640培养基，并加入GM-CSF及IL-4细胞因子(均购于Peprotech公司)，终浓度均为10 ng/ml。将获得的单个核细胞用上述联合培养基重悬，于6孔板中培养，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。48 h后全量换液，弃去漂浮的细胞，并再加入上述联合培养基继续培养，隔天进行半量换液。继续培养至第7天，收集细胞及上清用于实验检测。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞表型 收集培养第7天的细胞，与用异硫氰酸酯(FITC)或藻红沅素(PE)标记的流式抗体CD80、CD86、CD40及MHCⅡ(均购于eBioscience公司)混合，4℃孵育30 min，PBS洗涤2次后，每管加入300 μl的PBS溶液重悬后，上流式细胞仪进行检测，记录结果为阳性细胞所占的比例。

1.2.3 细胞因子检测 收集培养第7天的细胞上清，严格按照试剂盒说明书，应用TNF-α、 IL-12 酶联免疫试剂盒(均购于eBioscience公司)，检测上清细胞因子含量。

1.2.4 同种混合淋巴细胞反应 取健康志愿者外周血10 ml，经过淋巴细胞分离液梯度离心后获取单个核细胞，PBS洗涤后，于培养皿中培养，置于37℃、5%CO2培养箱中，24 h后收集悬浮细胞，视其为淋巴细胞。将收集培养第7天的DCs用丝裂霉素C 25 μg/ml，处理 45 min后用PBS洗涤收集细胞，用10%胎牛血清的1640培养基重悬，调整细胞浓度为1×106ml-1，取100 μl置于96孔板中。并将淋巴细胞也用10%胎牛血清的1640培养基重悬，调整细胞浓度为1×106ml-1，也取100 μl置于96孔板中，使DCs与淋巴细胞混合的最终容积为200 μl，然后置于37℃、5%CO2培养箱培养72 h。于培养结束时向每孔加入20 μl的MTS/PMS混合液，培养3 h后，应用光密度仪进行光密度检测，以OD值来反应淋巴细胞增殖程度。

2 结果

2.1 各组对象外周血DCs表面共刺激分子表达LN患者与对照组相比，外周血DCs表面表达的CD80、CD86、CD40及MHCⅡ明显高于对照组，各组均存在统计学意义(P<0.05)，具体见表1。

2.2 各组对象外周血DCs细胞因子分泌LN患者与对照组相比，外周血DCs分泌的TNF-α、IL-12明显高于对照组，各组均存在统计学意义(P<0.05)，具体见表2。

2.3 各组对象外周血DCs刺激淋巴细胞增殖反应LN组和对照组IL-12含量分为2.6±0.5、1.2±0.6，可见LN患者外周血DCs刺激淋巴细胞增殖反应能力明显高于对照组，各组均存在统计学意义(P<0.05)。

GroupsCD80CD86CD40MHCⅡLNgroup61.3±5.91)90.2±6.91)52.9±5.81)85.6±5.11)Normalcontrolgroup50.3±5.680.6±6.146.2±6.575.9±4.9

Note：Vs normal control group,1)P<0.05.

GroupsIL-12TNF-αLNgroup210.6±11.21)321.6±15.21)Normalcontrolgroup150.6±10.6150.8±14.9

Note：Vs normal control group,1)P<0.05.

3 讨论

LN作为一种严重危害人类健康的自身免疫性疾病，多种致病因素均可诱导其发病，其确切病因至今未明，但多种研究认为四大因素是LN的主要发病因素：①遗传缺陷：研究发现LN发病具有家族聚集性，存在多种易感基因，其发生补体基因缺陷的频率较高，存在较多的凋亡基因及免疫球蛋白受体基因，均可导致疾病的发生发展；②环境因素：其中紫外线、化学损伤，如含铅苯的化学试剂，可疑刺激因素，如感染和饮食等；③性激素异常：均可导致免疫功能紊乱，从而影响LN发病；④免疫因素：多种细胞因子、生长因子及自身抗体都参与了疾病的进展[5-7]，多项研究表明Th1/Th2细胞的极化在LN发病过程中起着重要作用。

DCs起源于骨髓造血干细胞，为目前已知的功能最强的专职抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells，APC)，具有独特的刺激 naïve T 细胞活化的能力，是连接固有免疫和适应性免疫的“桥梁”。近年来，随着 DCs 生物学特性和功能的深入研究，发现DCs 的成熟状态是决定其有效呈递抗原的关键因素，会直接影响免疫应答的反应，从而影响机体的各种生命活动[8,9]。正常机体绝大多数DCs处于未成熟状态，多位于实体器官及非淋巴组织的上皮，具有较强的抗原摄取能力，但抗原递呈及表达协同刺激分子能力较弱。未成熟DCs摄取抗原后，迁移到引流淋巴结，逐渐发育成熟，成为成熟DCs，高表达MHC类分子及CD80、CD86、CD40等共刺激分子，分泌IL-12、TNF-α等炎性细胞因子，激活T细胞应答，诱导免疫反应[10]。然而，树突状细胞也可以分泌抗炎性细胞因子，如IL-10，可通过诱导免疫耐受，或是促进Th2细胞分化来影响免疫反应[11]。

本研究可以看出，与健康对照组相比，LN患者外周血DCs表面表达的共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHCⅡ数量明显升高(P<0.05)；DCs分泌的TNF-α、 IL-12致炎性因子明显升高(P<0.05)；DCs刺激淋巴细胞增值反应能力明显升高(P<0.05)。即与健康对照组相比，LN患者外周血DCs呈现较成熟的状态，可诱导淋巴细胞增值，推测其在调节 Th1/Th2平衡中可能起到重要作用，但仍需进一步研究探讨。

综上所述，相对于健康对照者，LN患者外周血DCs呈现一种较成熟的状态，即DCs参与了LN疾病的发生与发展，并在其中起着重要作用，因此临床可开展针对DCs的干预来治疗或改善LN的病程。

[1] 蔡敏超,周 同,黄 娟，等.足细胞DC-SIGN表达及其在狼疮肾炎免疫炎性反应中的作用[J].中华肾脏病杂志,2014,30(12):925-932.

[2] 刁斌斌,李首庆,马寅芙，等.重组质粒 pchIL-18-MAGE 转染树突状细胞疫苗体外杀伤肝癌细胞的研究[J].中国免疫学杂志,2014,34(12):1606-1610.

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[4] 黄 燕,姜 毅,段蕴铀，等.树突状细胞在结节病免疫发病机制中的作用[J].细胞与分子免疫学杂志,2014,30(1):104-107.

[5] 孙吉平,赵 菲,张文静，等.淋巴细胞表型和细胞因子表达谱与Ⅳ型狼疮性肾炎患者免疫学发病机制[J].中南大学学报(医学版),2014,39(5):458-464.

[6] 刘 军,唐丽洁,包瑾芳，等.ImmuKnow免疫细胞功能监测在狼疮性肾炎并发感染中的价值及感染相关危险因素的初步分析[J].中华医学杂志,2014,94(6):424-427.

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[10] Jaeyun Kim,Weiwei Aileen Li,Warren Sands，etal.Effect of pore structure of macroporous poly(Lactide-co-GIycolide)scaffolds on the in vivo enrichment of dendritic cells[J].ACS Appl Mater Interfaces,2014,6(11):8505-8512.

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[收稿2015-07-09 修回2015-07-21]

(编辑 许四平)

Study on immune function of blood dendritic cells in patients with lupus nephritis

TAN De-Min,XIANG Yang,TAN Qian-Lin.University Hospital of Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,China

Objective:To investigate the different function of dendritic cells between patients with lupus nephritis and healthy control,and discuss the pathogenesis of the disease.Methods: Choose 50 healthy controls,50 patients with lupus nephritis,and isolation of blood dendritic cells. Then samples were induced with GM-CSF and IL-4,and cells were collected on day 7. DC maturity was evaluated using the following methods:fluorescence-activated cell sorting analysis for cell surface markers;enzyme-linked immunosorbent assay for cytokine production;cell proliferation assay for induction of T cell proliferation.Results: Compared with the control group,lupus nephritis group had increased MHC Ⅱ,CD86,CD80,and CD40 expression(P<0.05);displayed the increased IL-12 and TNF-α levels(P<0.05);displayed a increased ability to drive lymphocyte cells proliferation(P<0.05).Conclusion: Compared with the control group,dendritic cells in lupus nephritis group displayed the mature condition,which indicates that dendritic cells play the important role in the pathogenesis of lupus nephritis.

Dendritic cells;Lupus nephritis;Maturation

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.027

谭德敏(1980年-)，男，在读硕士，主要从事风湿肾病方面的研究，E-mail：tanminde_22@163.com。

R593.242

A

1000-484X(2016)04-0570-03