记忆性NK细胞的最新研究进展①

李婷婷 彭 慧 孙 汭 田志刚

(中国科学技术大学免疫学研究所,合肥230027)



·专家述评·

记忆性NK细胞的最新研究进展①

李婷婷 彭 慧 孙 汭 田志刚

(中国科学技术大学免疫学研究所,合肥230027)

一般认为NK细胞是一种天然免疫细胞，在抗病毒和抗肿瘤中发挥着重要作用。近年来的研究发现，NK细胞像适应性免疫细胞——T和B细胞一样，具有了免疫记忆的能力。早期研究发现半抗原可以诱导记忆性NK细胞并诱发接触性超敏反应，小鼠巨细胞病毒(mCMV)的感染和细胞因子的体外刺激也可以诱导记忆性NK细胞。而近期的研究发现，小鼠的单纯疱疹病毒(HSV)和流感病毒、人巨细胞病毒 (hCMV)、灵长类免疫缺陷病毒(SIV)也可以诱导记忆性NK细胞。本文主要总结上述多种实验体系中有关记忆性NK细胞的最新发现和尚未解决的问题。记忆NK细胞的研究将为NK细胞在治疗感染性疾病和肿瘤中提供新的机遇。

NK细胞；免疫记忆；功能；模型

李婷婷(1988年-)，女，2010年毕业于安徽医科大学生物技术专业，同年考入中国科学技术大学生命科学学院攻读硕士学位，师从田志刚教授。2012年开始攻读博士学位，主要从事小鼠流感病毒感染中记忆样NK细胞的研究。

田志刚 (1956年-)，男，中国科学技术大学生命科学学院教授、博士生导师，现任中国科学技术大学生命科学学院免疫学研究所所长。中国免疫学会理事长，中国免疫学会英文会刊(Cell Mol Immunol)执行主编。2001年国家杰出青年基金获得者、2007年教育部创新团队负责人、2008 和 2011 年国家基金委《天然免疫与重大疾病发生发展》创新群体负责人。2008年获国家自然科学二等奖(首位)、2011年获国家科技进步二等奖(第二位)。2015年获何梁何利奖。主要从事天然免疫和肝脏免疫学研究，以通讯作者在Cell、Nat Immonol、Immunity、J Clin Invest、J Exp Med、PNAS、Nat Commun、Gastroenterology、Hepatology、J Allergy Clin Immunol、PloS Pathogen、J Hepatolo等SCI收录的国外杂志发表论文200余篇。

自然杀伤细胞(Natural killer，NK)于1975年因其形态特异性得以发现和命名[1]，表达多种淋巴细胞的标志，是由骨髓中的共同淋巴前体细胞发育而来。因为不表达可基因重排的受体，NK细胞一般被归类于固有免疫细胞。在稳态状态下，成熟NK细胞的生命周期较短，只有17 d左右[2]。NK细胞表面表达多种活化性和抑制性受体，维持NK细胞对宿主自身正常组织细胞的耐受和对异常组织细胞的杀伤能力。因此在机体抗肿瘤和早期抗病毒或胞内寄生菌感染的免疫过程中发挥重要作用。

随着研究的深入，发现NK细胞与适应性免疫T和B细胞仍有很多的相似性。这些相同点包括由共同淋巴前体细胞发育而来[3]，发育和稳态条件下需要γc链依赖的细胞因子(IL-15等)[4]，个体发生中表达Rag基因[5]，发育教育过程类似于胸腺T细胞[6]；而且虽然NK细胞受体不能进行基因重排，但依然可以特异性地识别某些来源于病原体或者压力诱导的抗原。而免疫记忆是区分固有免疫系统和适应性免疫系统的一个重要的部分。近年来的研究发现，NK细胞也具有免疫记忆的功能，能够长期存活，在再次抗原刺激时，NK细胞的功能增强。虽然记忆NK细胞的概念提出仅十年，但是有研究人员提出NK细胞的记忆功能的存在可以追溯到1964年[7]。在骨髓移植模型中，H2杂合型的F1代小鼠对于亲代的骨髓会发生排斥；更加值得关注的是，给F1代小鼠再次进行骨髓移植时，排斥现象发生的更快。但用亲代的脾脏细胞进行反复的输注，F1代小鼠能耐受亲代的骨髓移植[8]。后续的研究发现NK细胞特异地介导了骨髓移植排斥[9]。因此，骨髓移植模型提示NK细胞可能具有免疫记忆能力，并能诱导免疫耐受。本文综述了目前发现的多种研究体系中记忆NK细胞的最新发现、形成机制和尚未解决的问题，希望对后续记忆NK细胞的研究有所提示。

1 半抗原诱导的接触性超敏反应与NK细胞的免疫记忆功能

自2006 年Von Adrian[10]首先在半抗原诱导的接触性超敏反应模型中提出记忆性NK细胞后，近十年来，NK细胞的免疫记忆功能成为NK细胞研究领域中的一个重要部分。在该模型中，用化学半抗原(DNFB,OXA等)涂抹于Rag1-/-鼠的腹部致敏。4～5 d后，用相同的半抗原涂抹耳朵能显著增加耳朵的厚度。而未致敏和用不同的半抗原致敏时，在再次刺激后，小鼠耳朵的厚度并未增加。在野生型鼠中，研究发现接触性超敏反应是由T细胞介导的[11]，但应用Rag1-/-鼠和Rag1-/-γc-/-鼠[10]，及SCID鼠和SCIDbeige鼠[12]进行实验，发现NK细胞也能介导这一过程。

1.1 半抗原特异性的记忆NK细胞定居于肝脏中 过继性转输实验发现只有转输肝脏NK细胞的受者鼠在再次相同半抗原刺激时，耳朵的厚度才能显著增加[10,12-14]。Von Adrian等[10]首次提出肝脏记忆性的NK细胞亚群属于较为成熟的Thy1+Ly49C/I+NK细胞，而这群NK细胞仅占肝脏总NK细胞的10%左右。应用抗体阻断各种黏附分子(L-选择素，整合素CD18，P-选择素，E-选择素)，发现记忆性NK细胞可能是在淋巴结中形成的，且它的迁移受到黏附分子的调控。Paust等[13]发现记忆性NK细胞在肝脏中的聚集是依赖于CXCR6，可能是肝窦细胞产生的趋化因子CXCL16招募CXCR6+NK细胞向肝脏聚集；但CXCR6并不参与抗原的特异性识别，而在调控记忆性NK细胞的效应功能和存活上有重要作用。另外，肝脏CXCR6+NK不仅能记忆化学小分子半抗原，还对病毒样颗粒有记忆能力。主要体现在用包含流感病毒或HIV的病毒样颗粒(PR8/HIV-VLP)或减毒的水疱性口炎病毒(UV-VSV)致敏小鼠，再用相同的病毒样颗粒刺激时，小鼠耳朵的厚度显著增加；或者在病毒感染时能显著延长小鼠的生存期。而且NK细胞对于化学半抗原和病毒样颗粒的免疫记忆不需要抗原的持续存在。

1.2 半抗原特异性的记忆NK细胞的表型和形成机制 近期Majewska-Szczepanik等[12]发现半抗原特异性的NK细胞可能是天然存在的。因为半抗原致敏30 min的肝脏NK细胞即可介导受者鼠的过敏性皮炎，而如此短的时间是不足以进行NK细胞的扩增。而且记忆性NK细胞呈现成熟样CD11b+CD27-的表型，在半抗原致敏后上调Thy-1的表达。同时应用各种缺陷鼠NK细胞的转输实验，发现半抗原特异性的记忆NK细胞的形成或效应过程需要IFN-γ、IFN-α和IL-12。本实验室的研究[14,15]也发现肝脏中存在有一群驻留的CD49a+DX5-NK细胞，是由肝脏中的造血前体细胞发育而来，不会向外周组织迁移。而且这群NK细胞介导了半抗原的迟发型超敏反应。那么在半抗原刺激时，肝脏特有的NK细胞是怎么引起小鼠耳朵肿胀的？鉴于肝脏CD49a+DX5-NK细胞的驻留特性，有可能发生表型转变后迁移至炎症部位，介导过敏性反应。有研究人员将肝脏CD49a+DX5-NK细胞归类于固有样细胞-1(ILC-1)[16]，而本实验室的研究中将肝脏驻留NK细胞和肠道经典的ILC-1细胞进行比较，发现它们在表型，转录因子表达和功能上都存在较大的不同[17]。在人的肝脏中，Marquardt等[18]也发现有一群类似的T-bet+Eomes-CD49a+NK细胞，但是这群细胞是否参与过敏性反应有待进一步研究。

在半抗原介导的迟发型超敏反应中，记忆NK细胞的产生过程仍有很多未解之谜。首先，NK细胞是如何识别半抗原的？化学半抗原(DNFB、OXA等)和病毒样颗粒(VSV、HIV、流感病毒)的结构多样，因此不可能是通过同一个NK受体识别的。而CXCR6是一种胚系基因编码的受体，并不能基因重排，因此其识别的配体也是有限的。而肝脏CXCR6+NK不表达Ly49H和Ly49D，低表达Ly49A、C/I、F、G2受体[19]。因此目前并不能确定NK细胞是通过何种受体识别这些抗原物质。另外在抗原再次刺激时，肝脏中记忆性NK细胞是否能够直接迁移到炎症部位和NK细胞的迁移及黏附的具体机制需要进一步研究。

2 慢性病毒感染与记忆性NK细胞

巨细胞病毒(CMV)是一种疱疹病毒组DNA病毒，对宿主或培养细胞有高度的种属特异性，是一种能够长期感染宿主的慢性病毒[20]。尽管T细胞在控制CMV的潜伏和再活化中有重要作用[21]，NK细胞在CMV的急性感染期也有着重要功能[22,23]。

2.1 MCMV感染中记忆NK细胞 在小鼠记忆性NK细胞的研究模型中，MCMV感染模型研究的最为清楚。在C57BL/6鼠的脾脏中，约50%的NK细胞表面表达胚系编码的活化性受体Ly49H，且该受体能够特异性地识别MCMV的m157蛋白，而这对受配体的特异性结合确保了NK细胞对MCMV的清除[24]。应用MCMV感染模型，Lanier和Sun研究组发现NK细胞和CD8+T细胞类似，经历抗原活化增殖期和收缩期，最终形成长期存活的抗原特异性的记忆NK细胞[25,26]。在MCMV感染的早期(7dpi)，外周脾脏组织和MCMV感染的肝脏组织中，Ly49H+NK细胞特异扩增，比例达到总NK细胞的80%以上。为了研究病毒特异性Ly49H+NK细胞的扩增和长期存活，将Ly49H+NK细胞转输给Ly49H-/-鼠或DAP12-/-鼠。用MCMV感染受者鼠，Ly49H+NK细胞在脾脏中扩增100倍，在肝脏中扩增1 000倍。但用缺失m157蛋白的MCMV感染后，Ly49H+NK细胞并未扩增。而后NK细胞经历收缩期，数目减少，但Ly49H+记忆NK细胞在受者鼠中依然能维持半年以上，提示Ly49H+NK细胞可能具有自我更新的能力或存活能力增强。此外，Ly49H+记忆NK细胞比naïve NK细胞具有更强的抗病毒能力。且Ly49H+记忆NK细胞呈现KLRG1hi、CD11b+、CD27-、Ly6chi。在MCMV感染中形成的记忆NK细胞并没有组织特异性，在病毒感染的肝脏组织和外周脾脏组织中均有记忆性NK细胞的形成，并能长期存在。

为了确认记忆NK细胞的特异性，Min-Oo和Lanier[27]构建了如下模型：预先给Ly49H-/-鼠转输CD45.1+Ly49H+NK，用MCMV进行感染，在感染后期再次转输naïve CD45.2+Ly49H+NK，接着进行流感病毒或单核李斯特菌的感染。在感染后第1和4天，naïve NK细胞和记忆NK细胞的数目、活化水平和功能分子的表达均无显著差别。另外，在体外实验中用多种细胞因子(IL-12+IL-18或IFN-β)刺激时，与naïve NK细胞相比，记忆NK细胞产生IFN-γ的能力下降。这可能是记忆NK细胞中细胞因子下游信号通路(IL-12-STAT4/IFN-STAT1)的活化减少。但用m157特异刺激Ly49H时，记忆NK细胞产生更多的IFN-γ，脱颗粒能力也增加。这些结果显示Ly49H+记忆NK细胞对MCMV具有高度的特异性，而对细胞因子刺激的反应性降低，这可以避免非特异感染诱导的不可控的NK细胞的活化。

2.1.1 MCMV感染中记忆NK细胞的活化和扩增 随着MCMV感染模型中记忆NK细胞的发现，近期的研究主要集中于记忆性NK细胞的形成机制和影响因素。因为MCMV特异的记忆NK细胞与记忆性T细胞的形成过程类似，那么记忆性T细胞形成过程中的影响因素是否也影响记忆NK细胞有待研究。T细胞的活化需要3种信号的共同作用：TCR和MHC分子的相互作用，共刺激信号(CD28等)和 细胞因子信号(IL-18/IFN-α等)[28]。而MCMV的感染过程中，NK细胞的活化是否也需要类似的三种信号呢？ 首先，NK细胞的Ly49H受体与病毒蛋白m157的结合[29]，这类似于T细胞活化过程中的TCR信号。其次，NK细胞表面活化性受体DNAM-1/CD226通过下游Fyn信号和PKCη信号对于记忆NK细胞的形成非常重要[30]。用抗体阻断DNAM-1，Ly49H+NK细胞的扩增和记忆NK细胞的形成受到抑制。这一研究提示抗原特异性NK细胞的活化和扩增需要共刺激活化信号。最后，细胞因子的信号对于抗原特异性NK细胞的形成也是必需的。研究发现MCMV感染诱导产生大量炎性细胞因子(IL-12、IL-18、Ⅰ型IFN和IFN-γ)。Ly49H+NK细胞活化扩增依赖于IL-12和下游STAT4信号[31]；IL-18[32]和IL-33[33]仅影响NK对MCMV的初次免疫应答，在记忆性NK细胞的形成、维持和再次抗病毒过程中并没有作用。近期研究发现，病毒感染和炎性细胞因子诱导的NK细胞扩增依赖于转录因子Zbtb32，且病毒感染诱导NK细胞中Zbtb32的上调，对于NK细胞的抗病毒能力非常重要[34]。而Zbtb32通过抑制抗增殖因子Blimp-1(Prdm1)促进NK细胞增殖。因此，MCMV感染中NK细胞的活化增殖同样需要炎性细胞因子，这类似于T细胞的活化信号3。综上所述，抗原特异性NK细胞的活化与T细胞相似，需要多种信号通路的协同作用，但抗原特异性NK细胞的扩增和形成记忆是否还需要其他的转录因子、细胞因子或共刺激信号等还需要进一步研究。

NK细胞除了通过Ly49H识别MCMV的m157蛋白之外，目前的研究发现NK细胞表面的多种受体也能与特定的配体结合。在异基因的造血细胞或组织移植中，C57BL/6鼠(H2-Dk)的NK受体Ly49D能特异性的识别H2-Dd。应用这一组受配体对，Nabekura和Lanier提出[35]，在MCMV感染或炎性条件下，异基因的细胞转输能特异性的活化Ly49D+NK细胞，并形成记忆NK细胞。这一研究进一步证实，NK细胞的扩增与分化不仅需要特异性受配体的结合，还需要合适的炎性环境提供必要的生长和分化因子。

在某些病毒感染或者化疗和辐照导致的淋巴细胞减少时，淋巴细胞也会出现增殖以维持细胞数目的稳定[36,37]。那么在这种条件下，扩增出来的NK细胞的生存周期和功能与正常NK细胞之间是否存在差异呢？Sun等[38]将CD45.1+NK细胞转输给免疫系统完全缺陷的Rag1-/-γc-/-鼠，供者NK细胞出现显著的扩增和收缩现象；转输6个月后，依然可以检测到供者细胞。而且在淋巴组织(脾脏)和非淋巴组织(肝脏)中都有这群长期存活的NK细胞。在MCMV感染时，长期存活的NK细胞与naïve NK细胞一样快速的活化和增殖，且时相没有显著差别。鉴于之前的研究发现MCMV特异性的Ly49H+NK细胞与naïve NK细胞的活化增殖的时相也非常相似，这提示可能所有NK细胞的分裂增殖周期都是相似的。但是在体外实验中，用铺板的抗体(anti-Ly49H/anti-NKp46等)进行刺激时，长期存活的NK细胞的细胞因子分泌和脱颗粒能力比naïve NK细胞显著增加。说明只要NK细胞经历稳态扩增就能诱导NK细胞产生效应性细胞因子，具有记忆样特性。然而，NK细胞的稳态扩增诱导记忆样NK细胞的形成受到哪些因素的影响还有待研究。T细胞的稳态扩增受到一些共用γc链的细胞因子(IL-15、IL-7、IL-21)和MHC-TCR相互作用的影响[39]。而IL-15在NK细胞发育和存活中有着重要的作用，那么对于稳态扩增中NK细胞的存活，IL-15可能也发挥着重要作用[37]。因此，后续的研究需集中于何种因素影响长期存活NK细胞形成，及其与抗原特异性NK细胞在功能和表型等方面的异同。

2.1.2 MCMV感染中记忆NK细胞的稳态收缩 T细胞的收缩期在记忆性T细胞的形成中是一个关键的阶段，在该阶段，效应性T细胞的有序凋亡受到多种因子的调控[40]。Bim介导的细胞凋亡对于T细胞的收缩非常重要[41]。基于此，Min-Oo等[42]应用转输体系将Bim-/-NK细胞和正常NK细胞共转输，在MCMV感染后期Bim-/-NK细胞能够长期存活，但呈现相对不成熟的表型，且对病毒的再次刺激反应性较低。这一结果显示，Bim介导的细胞凋亡对于记忆NK细胞的形成至关重要。早期研究发现，NK细胞的存活和维持阶段IL-15发挥着重要作用[43]；除了细胞因子的影响外，miRNA-155[44]通过抑制凋亡相关分子Noxa和SOCS1维持NK细胞的扩增。尽管如此，在收缩期，效应NK细胞长期存活的机制仍不清楚。最近，Sun研究组发现在NK细胞的收缩期，线粒体自噬通过ROS依赖的途径促进NK细胞存活，并形成记忆性NK细胞[45,46]。用雷帕霉素抑制mTOR信号和用二甲双胍活化AMPK信号时，线粒体的自噬增加，从而促进记忆性NK细胞的增多。且这一过程依赖于Atg3信号。同时，线粒体自噬诱导BNIP3和BNIP3L的表达，也能促进记忆NK细胞的形成。

2.1.3 MCMV感染中记忆NK细胞的长期记忆形成 在感染过程中，抗原特异性CD8+T细胞能形成终末分化的KLRG1hi短期效应细胞(SLECs)和KLRG1lo记忆前体效应细胞(MPECs)[47]。那么在MCMV感染中，经历收缩期存活下来的NK细胞能否全部转变成记忆NK细胞？就目前的研究可见，答案是否定的。在MCMV感染中， KLRG1-Ly49H+NK细胞相较于KLRG1+Ly49H+NK细胞的增殖能力更强，更好地形成记忆NK细胞[48]。在记忆NK细胞的形成过程中受到共生菌的影响，因为髓样细胞中的NOD样受体能感知共生菌并产生IL-15，从而促进NK细胞的成熟，KLRG1+NK比例增加。但T细胞与NK细胞竞争IL-15，抑制NK细胞的成熟。因此共生菌和T细胞以相反的作用，维持体内NK细胞的成熟程度，也影响了记忆性NK细胞前体的本底水平。另外，最近的研究报道RAG基因促进NK细胞的适应性[5,49]。虽然成熟NK细胞中并不表达Rag基因，但是Kamimura等应用RAG fate-mapping鼠发现，约20%～30%的外周血NK细胞和40%～50%的骨髓NK细胞在个体发生过程中曾经表达过Rag基因。这群曾经表达过Rag基因的NK细胞的成熟度(KLRG1/CD11b)、活化水平和反应性较低。但是在MCMV感染时，因为这群NK细胞的DNA损伤修复功能较强，导致NK细胞的适应性增加，在感染后期能长期存活并形成记忆性NK细胞。综上所述，这些研究提示，虽然目前的研究尚未明确何种因素决定效应NK细胞向记忆NK细胞转变，但确实存在一些细胞内源性的因素或环境因素影响记忆NK的形成。

2.2 HCMV感染中的记忆性NK细胞 人器官和造血干细胞移植后巨细胞病毒(CMV)感染是普遍存在的问题[50-52]。研究发现，CMV血清阳性的病人体内CD94/NKG2C+NK细胞增多，而这群细胞不表达抑制性受体CD94/NKG2A，低表达活化性受体NKp30和NKp46[53]。这提示HCMV的感染选择性的影响NK细胞表面受体的表达。后续研究发现，CD94/NKG2C+NK具有记忆特性。Lopez-Vergès等[54]发现CMV血清阳性病人的外周血中NKG2ChighCD57+NK细胞较正常人显著增加；而CMV携带者在器官移植后诱发的CMV急性感染时，CD94/NKG2C+NK特异扩增，并能长期存活持续到至少250 d。Foley等[55]发现在造血干细胞移植的病人中，NKG2ChighCD57+NK细胞扩增并长期存活，且呈现成熟表型，CD57和KIR高表达。另外有研究报道[56]，一个T细胞缺陷的新生儿在HCMV急性感染时，随着病毒滴度增加，外周血中约80%的NK表达NKG2C。而在NKG2C基因(Klrc2)缺陷的个体中，HCMV感染时，NK细胞的分化成熟受损，抗HCMV IgG增加，这说明NKG2C在宿主抵抗HCMV感染中有着重要作用[57,58]。但也有文献报道[59]，NKG2C缺陷的个体依然能控制HCMV的感染，可能是NK细胞通过表达活化性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)或者其他相关受体识别HCMV。因此人NK细胞可能通过其他的补救途径对抗HCMV。综上所述，CMV的感染在小鼠和人体内均能诱导形成长期存活的记忆NK细胞。

鉴于MCMV感染中，NK细胞的Ly49H受体与MCMV-m157相互作用，特异性地诱导NK细胞的扩增。那么在HCMV感染时，具体是何种配体诱导了CD94/NKG2C+NK的增殖还有待研究。Rolle等[60,61]研究发现HCMV感染诱导被感染细胞上HLA-E的表达上调，促进CD14+单核细胞分泌IL-12，两者联合作用导致NK细胞上CD25表达增加，从而促进CD94/NKG2C+NK细胞的扩增。但CD94/NKG2C与HLA-E的亲和力较低，且HLA-E的表达谱较广[62]。目前HCMV是如何诱导CD94/NKG2C+NK的扩增的假设主要有以下两种[23]：第一可能是CMV感染后影响了HLA-E的多肽库，形成高亲和力的HLA-E配体。第二点可能是感染细胞上表达的CMV蛋白或某些新的宿主自身蛋白作为高亲和力的配体，活化CD94/NKG2C+NK。

不仅在HCMV的感染中伴有CD94/NKG2C+NK的扩增，一些其他的病毒感染也能诱导这群细胞的增多。那么在这些病毒感染中，是否也有记忆NK细胞的形成还有待研究。在慢性HBV、HCV、HIV和汉坦病毒感染的病人中，CD94/NKG2C+NK也会扩增[63-65]。基孔肯雅病毒(chikungunya virus)的感染亦可诱导CD94/NKG2C+NK瞬时扩增和长期存活[66]。然而，上述病毒感染时，仅仅CMV血清阳性的病人才有此现象。但Hendricks等[67]发现在EB病毒和HCMV的共感染中，CD94/NKG2C+NK并没有扩增，NKG2A+CD57+的比例也没有增加。另外单纯疱疹病毒HSV-2反复感染的病人，与无症状的HSV-2携带者相比，外周血中CD94/NKG2C+NK也没有增多[68]。但该研究中并没有HSV-2阴性的个体，且没有检测CMV血清状态。因此，这些病毒感染中，究竟是病毒还是伴随的细胞因子诱导了CD94/NKG2C+NK的活化扩增尚需更深入的探索。

有研究发现，在人体中一些其他的病原体亦可诱导某些特异NK细胞群体的扩增。流感疫苗免疫后，外周血中NK细胞表面CD244表达增加，NKp46表达下降。而体外流感病毒感染的单个核细胞中NK细胞也呈现相似的表型[69]。而肺炎结核杆菌感染时，胸腔积水中有一群NK细胞表达记忆性T细胞特异性的标志CD45RO。在IL-12刺激时，这群细胞的杀伤能力和产生IFN-γ的水平较CD45RO-NK细胞显著增加[70]。另外，HIV携带者体内成熟的CD57brightNK也较多[71]。但是这些NK细胞群体是否具有记忆特性还需要进一步研究。

2.3 抗体依赖的记忆样NK细胞 NK细胞的一个重要功能是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)，即表达IgG Fc受体的NK细胞通过与已结合在病毒感染细胞和肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，而杀伤这些靶细胞的作用。CD16通过下游两个接头分子CD3ζ和FcεRIγ传递信号，CD16和IgG结合后，导致CD3ζ和FcεRIγ的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)磷酸化，进一步招募酪氨酸激酶Syk和ZAP70，导致NK细胞介导的杀伤和细胞因子的产生[72,73]。近期Kim研究组[74]发现，在健康人中，约有30%的人外周血中有一群CD56+CD16+NK细胞不表达FcεRIγ，低表达活化性受体NKp46和NKp30。这30%的人群可能是曾经感染过CMV所致[75]。FcεRIγnegNK细胞与FcεRIγposNK细胞有很大的功能差异，FcεRIγnegNK细胞的杀伤能力下降，但是ADCC效应能力增强。在有病毒特异性抗体时，FcεRIγnegNK细胞的脱颗粒能力(CD107a)和产生细胞因子(IFN-γ和TNF-α)的能力增加。而且这群NK细胞表面伴有CD94/NKG2C和CD57的表达上调，这就提示这群NK细胞可能也有记忆功能。最新的研究中，Lee[76]和Schlums[77]等发现FcεRIγneg记忆样NK细胞具有特异的转录因子和信号蛋白表达谱，也呈现不同的表观调控。这群NK细胞低表达ITGA6、SIGLEC-7、CD7、PECAM1和TIM-3，高表达ILT2、CD2和FAS[76]。CMV血清阳性的个体中FcεRIγnegNK细胞的酪氨酸激酶Syk的表达缺失，也不表达转录因子PLZF和DAB2和接头分子EAT-2[76,77]。因此，这群FcεRIγneg记忆样NK细胞与传统NK细胞有较大的功能差异，但是与CD8+T细胞非常类似。但是，鉴于这群NK细胞的特异性是由抗体介导的，因此它可以对于多种病原体进行杀伤。与NK细胞受体介导的杀伤相比，其特异性更加广谱。

2.4 免疫缺陷病毒感染中的记忆样NK细胞 人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus 或HIV)是感染人类免疫系统细胞的慢病毒(Lenrivirus)，属逆转录病毒的一种。NK细胞在HIV感染时具有重要的抗病毒能力，且HIV感染也能影响NK细胞的表型和功能[78]。临床资料表明[79,80]，HIV携带者的外周血NK呈现高度活化状态，增殖能力增强，受体表达异常，与DC的相互作用受损，CD56dimCD16+NK细胞减少。而CD56dimCD16+NK细胞上CD57上调。另外，NK细胞通过多种机制裂解HIV感染的细胞，主要包括ADCC[81]，下调MHCⅠ分子[82]，上调NKG2D的配体[83]。NK细胞也分泌趋化因子CCL3、CCL4和CCL5抑制CCR5依赖的HIV侵入靶细胞[84]。而在HIV携带者体内成熟的CD57brightNK增多，是否能形成记忆样NK细胞还有待研究。研究发现，越南静脉吸毒者有很高的HIV感染机率。但尚未感染与已感染的吸毒者相比，外周血NK细胞的杀伤功能较强[85]。因此可能是这些功能增强的NK细胞抵抗HIV的感染。另外HIV携带者的母亲能产下HIV阴性和阳性的胎儿，而HIV阴性的胎儿外周血的NK细胞，在HIV抗原体外刺激时，能产生更多的IFN-γ。这也提示，母体来源的HIV刺激胎儿的NK细胞，导致功能增强，从而阻断了HIV的母婴传播[86]。综上所述，HIV的感染或刺激，能诱导产生功能增强的记忆样NK细胞。另外，NK细胞对HIV的反应性依赖于宿主的KIR和HLA基因型，且HIV编码的蛋白能降低某些NK配体的表达水平[87-89]。最近的研究中[90]，使用质谱流式细胞术分析41种NK细胞相关受体的表达情况，发现新生儿NK细胞受体的多样性较成年人的低。而HIV或西尼罗病毒体外刺激，或HIV感染的越南女性中，NK细胞受体的多样性增加，且CD57+NK细胞比例增加，NK细胞产生IFN-γ的水平也较高。这说明在人类的整个生命周期中，随着遇到的病原体增多，NK细胞开始转变成抗原特异性的效应细胞，而对其他未见过的病原体则不能识别。这就导致成年人没有新生儿对病原体的抵抗力强。

在恒河猴免疫缺陷病毒感染(SIV)的研究中也发现，NK细胞能裂解感染的细胞[91]。在急性感染期，SIV能诱导NK细胞的快速活化，杀伤能力增强[92]。而长期的研究提出，NK细胞在疾病进程中起到保护性的效应[93]。那么在SIV感染中是否能诱导形成记忆样NK细胞呢？近期的研究发现[94]，SHIVSF162P3和SIVmac251感染后，恒河猴的脾脏和肝脏NK细胞能通过NKG2A和NKG2C依赖的途径特异性的杀伤Gag-和Env-负载的DC细胞。用表达有不同SIV抗原的Ad26疫苗免疫5年后，脾脏和肝脏NK细胞依然可以有效地裂解抗原相匹配的靶细胞。这一研究提出在恒河猴免疫缺陷病毒感染中能诱导形成长期存活，功能增强和特异性的记忆样NK细胞。这也提示利用疫苗诱导记忆NK细胞产生对免疫缺陷病毒的防治有着重要的潜在意义。

3 细胞因子诱导的记忆样NK细胞(CIML)

鉴于NK细胞不能进行体细胞抗原受体的基因重排，只依赖于胚系基因编码的有限受体来识别配体或抗原。如果仅通过受配体间的相互识别诱导记忆NK细胞形成，那么记忆性NK细胞的种类是非常有限的。但有研究报道细胞因子活化的NK细胞呈现记忆样特性。

3.1 细胞因子诱导的小鼠记忆样NK细胞 Yokoyama研究组[95]最早提出了细胞因子(IL-12、IL-15和IL-18)能诱导形成记忆样NK细胞。在体外用IL-12、IL-18和IL-15刺激Rag1-/-鼠的NK细胞，同时仅用IL-15刺激作为对照，过夜培养后转输给Rag1-/-鼠。尽管在转输时，预先活化的NK细胞产生IFN-γ的水平显著增加；但转输数周后，NK细胞产生IFN-γ的能力恢复至正常水平。在转输受者鼠中，预先活化的NK细胞比对照NK细胞的增殖能力更强。但这两种NK细胞的表型相似，CD69、CD11b、CD11c、gp49B、B220、CD122、IL-15Rα、IL-12Rβ1和CD127的表达水平没有差别。CIML和对照NK细胞的细胞毒作用也相似，主要表现在表达颗粒酶B和对靶细胞的杀伤能力没有差别。值得关注的是，在体外用细胞因子或anti-Ly49H/NK1.1进行刺激时，CIML NK细胞产生更高水平的IFN-γ。而且这种特性是NK细胞内在的，能够遗传给子代细胞。

目前细胞因子诱导的记忆样NK细胞的形成机制并不清楚。MCMV特异性的记忆NK细胞的活化与记忆性T和B细胞类似，需要抗原受体信号，共刺激信号和细胞因子。但CIML仅需要细胞因子的活化。CIML产生更多IFN-γ的机制可能是细胞因子诱导Ifng基因座的转录本增加[96]或发生了表观修饰[97]。而Yokoyama研究组[95]发现预先活化的记忆性NK细胞与naïve NK细胞相比，Ifng基因在mRNA水平上没有差别。因此后续的研究需要探究细胞因子的预先活化是否影响Ifng基因的表观修饰及其机制。

另外需要研究的是CIML是否具有组织器官特异性。研究发现在转输后7 d，预先活化的NK细胞比naïve NK细胞在淋巴结中的比例更高，在肝脏和脾脏中的比例相当；但介导NK细胞向外周淋巴结迁移的淋巴细胞归巢受体(L-选择素)CD62L在这两群NK细胞上的表达水平没有差别。但文中并未检测更长时间点供者细胞在各组织器官中的分布情况。因此CIML在体内的迁移、分布和影响因素等还需要进一步探索。

功能增强的CIML的发现给NK细胞的免疫治疗领域带来新曙光。Cerwenka等[98]用IL-12、IL-15和IL-18活化的小鼠NK细胞转输给荷瘤的小鼠(RMA-S淋巴瘤或B16-Rae1ε黑色素瘤)，联合辐照治疗能有效杀伤肿瘤细胞。这主要是NK细胞和CD4+T细胞的协同效应，CD4+T细胞产生的IL-2能显著诱导NK细胞的活化，从而杀伤肿瘤细胞。而且细胞因子预先活化的NK细胞能长期存活，在受者鼠中存活3个月以上，可以提供长期的抗肿瘤的效应。然而，因为细胞因子活化的NK对病原微生物的刺激也表现出强大的效应功能，可能导致机体严重的病理损伤。因此CIML是一把双刃剑，在不同肿瘤模型或宿主中的作用需要具体的分析。

3.2 细胞因子诱导的人记忆样NK细胞 继CIML在小鼠中发现，研究者的目光也聚集到细胞因子对于人NK细胞的影响及预先活化NK细胞在肿瘤治疗中的作用。Ni[98]和Romee[99]等用IL-12,IL-15和IL-18体外刺激人外周血NK细胞，与naïve NK细胞相比，预先活化的NK细胞上CD69、NKp46、CD94和NKG2A高表达。用细胞因子或靶细胞刺激时，这群NK细胞产生IFN-γ的能力增强，但杀伤功能没有显著增加。而且与小鼠中CIML类似，这种功能增强的效应也能随着细胞的增殖遗传给子代细胞。人NK细胞根据CD56的表达水平可以分成CD56bright和 CD56dimNK两群，在细胞因子刺激后，这两群NK细胞功能均显著增加。而人CIML功能增强的分子机制尚不清楚。目前的研究发现细胞因子的预先活化对NK细胞中Ifng基因的mRNA水平没有影响。因此可能与小鼠中类似，Ifng基因的表观调控是以后研究人记忆样NK细胞功能增强的一个方向。

4 流感病毒感染中的记忆样NK细胞

除了CMV等慢性病毒感染，一些急性感染的病毒也能诱导形成记忆性NK细胞。在牛痘病毒感染Rag1-/-鼠时，预先致敏的Thy1+NK细胞能保护致死剂量的牛痘病毒的感染[100]。在阴道单纯疱疹病毒HSV-2感染30 d后，体外用HSV-2抗原刺激时，脾脏NK细胞比naïve NK细胞产生更多的IFN-γ[101]。此外，在流感病毒感染中也发现有记忆样NK细胞，并取得较大研究进展。

流感病毒是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒。在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。自然条件下流感病毒不能感染小鼠，而鼠适应性流感病毒的发现，在小鼠中成功构建了流感病毒感染模型，对于流感病毒的研究提供了重要的研究平台[102]。在C57BL/6鼠中，流感病毒感染支气管上皮细胞，并在胞内快速增殖，导致严重的气道炎症，产生大量的细胞因子和趋化因子[102]。

NK细胞在流感病毒感染中的作用存在很大争议。早期的研究发现NK细胞能抵抗流感病毒的感染，起到重要的保护效应[103]。而且NK细胞通过活化性受体NKp46和NKp44识别流感病毒的血凝素HA[104,105]。近期Gazit等[106]发现在流感病毒感染时，Ncr1(NKp46)-/-鼠比野生型鼠的生存期缩短，肺脏病毒滴度更高。然而，近期研究发现IL-15-/-鼠[107]或用抗体清除NK细胞[108]，NK细胞的缺失并不影响流感病毒感染后小鼠的生存期，反而导致肺脏的病理损伤程度减轻。这一结果提示，在流感病毒感染中NK细胞诱导严重的肺脏病理损伤。因此NK细胞在流感病毒感染中究竟发挥怎样的作用尚无明确的定论。目前认为造成这两种完全相悖的现象的原因，可能是使用的流感病毒的亚型、种类和感染的剂量及实验中使用的小鼠的品系不同。

虽然在流感病毒感染中NK细胞的效应功能尚未明确，但是NK细胞的NKp46和NKp44受体确实能识别流感病毒的血凝素HA。那么流感病毒感染的细胞是否能通过NKp46活化NK细胞，诱导其增殖并形成记忆样NK细胞呢？Lannier研究组[7]用野生型鼠和Ncr1-/-鼠的NK细胞共转输和骨髓嵌合模型发现，流感病毒(H1N1和H3N2)的感染不能引起肺脏中NK细胞的扩增，反而引起骨髓中NK细胞的增殖，并通过趋化因子招募到感染部位。流感病毒仅在气道和肺脏局部扩增，这就说明流感病毒感染诱导的全身细胞因子风暴才是导致骨髓NK细胞扩增的主要因素，而并不是病毒抗原特异刺激NK细胞扩增[109]。其实早在半抗原诱导的CHS模型中，Paust等[13]发现流感病毒样颗粒致敏形成的记忆NK细胞并不依赖于NKp46和流感病毒HA的相互作用。虽然半抗原诱导的CHS反应和流感病毒感染的机制不同，但都发现流感病毒特异的记忆性NK细胞的形成不需要NKp46。尽管如此，流感病毒感染中产生的大量细胞因子是否能够诱导形成记忆样NK细胞还需要进一步的实验分析。

Van Helden等[109]最早提出流感病毒感染中存在细胞因子诱导的记忆样NK细胞，且主要定居于骨髓。在流感病毒感染2～3周后分离外周组织(脾脏、肝脏和肺脏)和骨髓中的NK细胞分别转输给naïve鼠，供者NK细胞倾向于返回其原来的位置，但都会在骨髓中经历扩增，形成长期存活的记忆样NK细胞。且在转输后4～5周依然能够检测到供者NK细胞。而用流感病毒和呼吸道合胞病毒均可引起这群NK细胞的活化增殖，说明流感病毒感染后形成的长期存活的记忆样NK细胞可能是由细胞因子诱导产生的，而不是依赖于某些流感病毒特异性的抗原。然而，我们发现在低剂量流感病毒感染后期，肺脏和肝脏NK细胞呈现记忆样表型(KLRG1hi，Ly6chi)和转录因子表达谱(Hopx高表达)。通过转输实验发现只有肝脏DX5-CD49a+NK细胞能增加受者鼠的生存率，并显著降低流感病毒的滴度。我们的实验提出流感病毒记忆样的NK细胞存在于肝脏中，具有DX5-CD49a+的表型(Li Tetal.,unpublished data)。但在该实验体系中仍有很多尚未解决的问题需要深入研究，例如呼吸道流感病毒感染中形成的记忆样NK细胞为何定居于肝脏中，肝脏中的记忆样NK细胞又是如何发挥抗病毒能力等。

在人流感病毒的研究中，我们实验室发现[110]用流感病毒疫苗免疫正常志愿者后，在体外用灭活流感病毒刺激外周血单个核细胞发现，疫苗免疫组比未免疫组的外周血中NK细胞产生更多的效应分子IFN-γ，而anti-NKp46的加入抑制IFN-γ的产生。进一步机制探索发现流感疫苗诱导NKp46内化的记忆样NK细胞。这与小鼠模型中得到的结果并不一致，可能是因为人和小鼠NK细胞上NKp46的表达谱不同所致。人NK细胞只有部分细胞表达NKp46，而小鼠(C57BL/6、BALB/c)的NK细胞是全部表达NKp46的。综上所述，在小鼠中流感病毒的感染能诱导形成记忆样的NK细胞，主要定居于骨髓和肝脏中；它可能主要是由细胞因子诱导产生，并不依赖于活化性受体NKp46。但是有关流感病毒记忆样NK细胞形成的具体机制和影响因素还需要进一步探讨。

5 总结与展望

越来越多的研究证实，在人和小鼠中存在记忆NK细胞，且记忆NK细胞形成的细胞和分子机制的研究也愈见明了。 MCMV的感染模型中发现NK细胞具有抗原特异性，形成长期存活的记忆NK细胞，并在再次刺激时发挥更强的抗病毒能力。而不管抗原存在与否，炎性细胞因子都能诱导形成记忆样NK细胞。但是，记忆NK细胞的研究中仍存在众多的未解之谜。随着NK细胞形成机制研究的不断更新和完善，可能对感染性疾病和肿瘤的治疗带来曙光。

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[收稿2016-01-13]

(编辑 张晓舟)

Advance in memory NK cells study

LI Ting-Ting,PENG Hui,SUN Rui,TIAN Zhi-Gang.Institute of Immunology ,University of Science & Technology of China,Hefei 230027,China

Natural killer (NK) cells have historically been considered short-lived cytolytic cells that can rapidly respond against microbial pathogens and tumors in an antigen-independent manner.Recently,NK cells have been shown to possess features of adaptive immunity with immunological memory in a manner similar to that of T and B cells.Three major viewpoints of NK cell memory initially arose from the studies of NK cell memory to recall to mouse cytomegalovirus (MCMV),cytokine and skin-contact hypersensitive chemical antigens.Currently,NK cell memory has been reported in acute infection of mouse HSV,influenza virus,HCMV and simian immunodeficiency virus (SIV).Here,we review the latest discoveries and unsolved questions regarding NK cell memory in these models.Studies to reveal the mechanisms for NK cell memory may provide opportunities for the therapeutic use of NK cells in infectious diseases and cancer.

NK cells;Memory;Function;Model

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.001

①本文为国家重点基础研究发展计划 (973)(No.2013CB944902)和国家自然科学基金(No.81361120388)资助项目。

R392

A

1000-484X(2016)04-0449-11