4种二烷基次膦酸盐阻燃剂对斑马鱼胚胎的毒性研究

陈敏杰，黎丽莎，陈冯杰，刘钰晨,*，张捷，梁勇,3,，刘继延

1. 江汉大学 医学院，武汉 430056 2. 华中农业大学 资源与环境学院，武汉 430070 3. 江汉大学 环境与健康研究院，武汉 430056 4. 江汉大学 光电化学材料与器件教育部重点实验室 化学与环境工程学院，武汉 430056



4种二烷基次膦酸盐阻燃剂对斑马鱼胚胎的毒性研究

陈敏杰1，黎丽莎2，陈冯杰2，刘钰晨1,*，张捷2，梁勇1,3,4，刘继延4

1. 江汉大学 医学院，武汉 430056 2. 华中农业大学 资源与环境学院，武汉 430070 3. 江汉大学 环境与健康研究院，武汉 430056 4. 江汉大学 光电化学材料与器件教育部重点实验室 化学与环境工程学院，武汉 430056

二烷基次膦酸盐(DPs)作为一种新型有机磷阻燃剂正在被大量合成并应用，但关于其毒理学效应的研究还十分匮乏。研究者首次以斑马鱼胚胎作为实验模型，初步探讨了2种新型DPs阻燃剂甲基环己基次膦酸铝(AMHP)、甲基环己基次膦酸钙(CMHP)和2种已市场化生产的DPs阻燃剂甲基乙基次膦酸铝(AMEP)、二乙基次膦酸铝(ADEP)对鱼类的急性毒性效应。结果表明，AMHP和CMHP对斑马鱼胚胎无明显毒性效应；500 mg·L-1的AMEP和ADEP能显著增加斑马鱼胚胎死亡率，降低其出膜率。AMHP和CMHP的水解产物甲基环己基次膦酸在浓度为1 000 mg·L-1时，可使斑马鱼胚胎出膜率下降，并导致胚胎死亡，推测DPs的水解产物二烷基次膦酸是造成斑马鱼胚胎死亡的主要因素。进一步比较去除卵膜后，DPs对斑马鱼胚胎的毒性效应，发现DPs主要通过影响斑马鱼胚胎的出膜进而造成胚胎的死亡。上述研究结果从水生生物毒性的角度为DPs阻燃剂是否能作为溴化阻燃剂和传统有机磷阻燃剂的替代品提供了实验依据。

二烷基次膦酸盐；二烷基次膦酸；斑马鱼胚胎；毒性

阻燃剂是用于改善材料易燃性的化学品。研究发现，多种大规模使用的溴化阻燃剂能够在水环境和食物链中累积，具有内分泌干扰效应[1-2]，对环境和人类健康造成了威胁，现已被包括美国和欧盟等越来越多的国家禁用[3]。以二烷基次膦酸盐(DPs)类为代表的新型有机磷阻燃剂作为溴化阻燃剂的优秀替代品，被广泛运用在化工、电子、纺织和建材等行业中[4]。其中，德国克莱恩公司开发的甲基乙基次膦酸铝(AMEP)、二乙基次膦酸铝(ADEP)阻燃剂在全球范围内已应用多年。甲基环己基次膦酸铝(AMHP)是我国自主研发，拥有知识产权的一种新型二烷基次膦酸盐阻燃剂，目前已经开始大规模生产和应用[5]。

虽然DPs已生产应用多年，但其环境毒性却没有受到相应的关注。2014年，牛宇敏等[6]在湖北一家DPs生产工厂附近的环境中检测到了多种二烷基次膦酸铝(ADPs)和其水解产物二烷基次膦酸(DPAs)的存在。在表层土壤中，ADPs和DPAs的含量分别为3.9 ～ 1 279.3 μg·kg-1和1.0 ～ 448 μg·kg-1。在废液废渣倾倒处和排污口的所有土壤和沉积物泥芯样品中均检测到ADPs，浓度范围为30.8 ～ 4 628.0 μg·kg-1；与此同时，DPAs的检出率> 90%，浓度范围为1.1 ～ 374.6 μg·kg-1。有研究发现，ADEP对大型蚤(Daphnia magna)具有中等程度的慢性毒性，21 d的半数致死量为3.2 mg·L-1[5]。此外，澳大利亚国家工业化学品通告评估署也曾报道，ADEP对大鼠、兔、荷兰猪具有极低的急性毒性。但是目前对其他DPs的毒理学研究还十分匮乏。

模式生物斑马鱼具有产卵周期短，产卵量大，胚胎体积小且透明，发育迅速等优势，可以观察多种毒性指标，因此被广泛运用于毒理学研究[7-9]。本研究以斑马鱼胚胎作为实验模型，首次比较研究了AMHP、甲基环己基次膦酸钙(CMHP)、AMEP和ADEP 4种典型的DPs，及AMHP和CMHP的水解产物甲基环己基次膦酸(MHPA)急性暴露后，对斑马鱼胚胎出膜率、死亡率和生长发育的影响及作用机制，初步评估了DPs作为环境友好型阻燃剂对高等水生生物的毒性效应。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

AMHP、CMHP和MHPA由江汉大学光电化学材料与器件教育部重点实验室合成，AMEP和ADEP购自德国克莱恩公司。这5种化合物的纯度均大于95%，其结构式如图1所示。

将AMHP、AMEP和ADEP溶于曝气水配成500 mg·L-1的储备液，CMHP和MHPA溶于曝气水中配成1 000 mg·L-1的储备液，持续搅拌24 h，开展暴露实验时直接用曝气水稀释成需要的工作浓度。

实验所用的AB系斑马鱼(Danio rerio)由中国科学院水生生物研究所赠予，饲养于流水养殖系统(上海海圣工贸有限公司)，按照《斑马鱼手册》提供的方法进行日常管理。

1.2 实验方法

暴露前1 天将成鱼按雌雄比例1:2配对，第2天早上收集自然产卵的胚胎并清洗干净。挑选出发育良好的胚胎，从受精后4 h (4 hour post-fertilization，4 hpf)开始暴露。AMHP、AMEP和ADEP的暴露浓度为0、50、100、200和500 mg·L-1，CMHP和MHPA的暴露浓度为0、50、100、200、500、1 000 mg·L-1，对照组为曝气水组。暴露实验在十二孔细胞培养板中进行。每个浓度共60粒胚胎，随机平均分配到3个平行孔中。暴露开始后，以24 hpf作为观察起点，每24 小时显微观察胚胎的发育情况，记录胚胎死亡数和出膜数、对发育畸形的个体拍照，并每隔24 小时更换新鲜的暴露溶液。根据实验需要，在暴露开始前、即4 hpf前，使用1%链蛋白酶人工去除斑马鱼胚胎的卵膜。

图1 化合物结构式Fig. 1 Structure of chemicals

图2 4种DPs暴露对斑马鱼胚胎死亡率的影响Fig. 2 The mortality of zebrafish embryo after 4 kinds of dialkyl phosphinate exposure

1.3 数据统计与分析

所有数据用“平均值±标准误差”表示。运用Graphpad Prism 5.0软件进行实验数据的统计。采用单因素方差分析(One way-ANOVA)计算显著差异。P<0.05表示与对照组比较存在显著差异；P<0.01表示与对照组比较存在极显著差异。利用logistic方程模型计算半数致死浓度[10]。

2 结果(Results)

2.1 DPs暴露对斑马鱼胚胎死亡率的影响

结果显示，对照组斑马鱼胚胎死亡率不超过5%。AMHP和CMHP各浓度暴露组和对照组比较，斑马鱼胚胎并没有发生明显死亡现象(图2a、2b)。最高浓度1 000 mg·L-1CMHP暴露引起斑马鱼胚胎死亡率略为升高，但无显著性差异。AMEP和ADEP暴露造成了斑马鱼胚胎的死亡(图2c、2d)；在最高浓度500 mg·L-1暴露实验中，与对照组比较，这2种化合物暴露的胚胎均从24 hpf开始死亡率显著升高；在200 mg·L-1暴露实验中，与对照组比较，AMEP和ADEP暴露的胚胎从144 hpf开始死亡率显著升高，168 hpf时AMEP和ADEP的半数致死浓度分别为288.79 mg·L-1和396.16 mg·L-1；其他各暴露组胚胎死亡率与对照组相比没有显著性差异。

2.2 DPs暴露对斑马鱼胚胎出膜率的影响

如图3所示，对照组斑马鱼胚胎从48 hpf开始出膜，到96 hpf时出膜率达100%。AMHP和CMHP暴露对胚胎出膜率没有显著影响(图3a、3b)；最高浓度1 000 mg·L-1CMHP暴露引起斑马鱼胚胎出膜率略为降低，但无显著性差异。50、100和200 mg·L-1AMEP和ADEP暴露对胚胎出膜率无明显影响，而500 mg·L-1AMEP和ADEP暴露后出膜率为0，与对照组比较有极显著差异(图3c、3d)。

2.3 MHPA暴露对斑马鱼胚胎死亡率和出膜率的影响

MHPA是AMHP和CMHP的主要水解产物。与对照组比较，1 000 mg·L-1MHPA暴露组胚胎的死亡率从24 h开始极显著升高，在120 hpf时死亡率达到100%(图4a)，168 hpf时MHPA的半数致死浓度为668.77 mg·L-1。1 000 mg·L-1MHPA暴露组胚胎的出膜率显著低于对照组(图4b)。其他各暴露组胚胎的死亡率与对照组比较均无显著差异，但出膜时间晚于对照组。

图3 4种DPs暴露对斑马鱼胚胎出膜率的影响Fig. 3 The hatching rate of zebrafish embryo after 4 kinds of dialkyl phosphinate exposure

图4 不同浓度MHPA暴露对斑马鱼胚胎死亡率和出膜率的影响Fig. 4 The mortality and hatching rate of zebrafish embryo after MHPA exposure

图5 AMEP和ADEP暴露对无卵膜胚胎死亡率的影响Fig. 5 Mortality of zebrafish embryo with removed chorion after AMEP and ADEP exposure

2.4 AMEP和ADEP暴露对无卵膜胚胎死亡率的影响

考虑到AMEP和ADEP可降低斑马鱼胚胎的出膜率并造成斑马鱼胚胎的死亡，500 mg·L-1AMEP和ADEP暴露后出膜率为0，其半数致死浓度分别为288.79 mg·L-1和396.16 mg·L-1。我们进一步利用酶解去除了卵膜的斑马鱼胚胎进行了相似的暴露实验。结果如图5所示，各浓度AMEP和ADEP暴露168 h后，无卵膜胚胎的死亡率相对未除卵膜时明显降低，其中200 mg·L-1AMEP和ADEP暴露组胚胎死亡率与对照组相比均无显著差异。而500 mg·L-1AMEP暴露后其死亡率由93%降低至37%，500 mg·L-1ADEP暴露后其死亡率由67%降低至28%。

3 讨论(Discussion)

作为新合成的有机磷阻燃剂，有机次磷酸盐的毒性大小及其潜在的环境影响鲜有文献报道。仅有2013年的一项研究表明，ADEP对大型蚤的生长和繁殖具有明显的毒性效应，其48 h半致死浓度为18 mg·L-1，暴露21 d的半致死浓度为3.2 mg·L-1，这表明有机次磷酸盐对低等水生生物具有一定的毒性效应[5]。因此本实验利用水生生物斑马鱼胚胎作为模型，初步探究了4种典型的DPs阻燃剂及其水解产物对斑马鱼胚胎死亡率、出膜率的影响。从化学结构来看，AMHP和CMHP具有相同的甲基环己基次膦酸基团和不同的金属离子；而AMEP和ADEP的结构式与AMHP相比，具有相同的金属离子和不同的烷基基团。因为溶解度限制，本实验中CMHP的最高暴露浓度可达1 000 mg·L-1，而其他3种DPs的最高暴露浓度只能设为500 mg·L-1。

实验结果显示，AMHP和CMHP对斑马鱼胚胎毒性效应微弱。而AMEP和ADEP暴露能对斑马鱼胚胎产生一定的毒性效应，并具有明显的剂量效应关系。与对照组比较，200 mg·L-1AMEP和ADEP暴露144 h后，胚胎死亡率显著升高；500 mg·L-1AMEP和ADEP暴露48 h后，所有胚胎的出膜均被抑制，且胚胎死亡率极显著升高。

据报道，在湖北云梦道桥镇AMHP中试车间附近的土壤、河流表层沉积物、土壤泥芯等环境样品均检测到不同浓度的AMHP、AMEP和ADEP，同时在环境样品还检测到上述有机次磷酸盐的水解产物——次膦酸，包括MHPA、甲基乙基次膦酸和二乙基次膦酸；这些结果表明有机次磷酸盐类可以持久残留在环境中，且易在环境条件下水解产生次膦酸；在被检测的环境样品中，有机次磷酸盐及其降解产物次膦酸都表现出了相对较高的纵向迁移率和较低的水平迁移率，显示有机次磷酸盐可能会同时以次膦酸的形式污染地下水[6]。因此，我们对AMHP和CMHP的水解产物MHPA的毒性效应进行了研究。结果显示，1 000 mg·L-1MHPA暴露组的胚胎从72 hpf开始，出膜率显著降低、死亡率明显上升。所以我们推测，CMHP、AMHP能通过水解为MHPA抑制斑马鱼胚胎的正常孵化，最终导致其死亡。现有文献中报道的ADEP对大型蚤的慢性毒性效应[5]，也可能是其特定的水解产物二乙基次膦酸所造成的。

由于暂时无法获得AMEP和ADEP相应的二烷基次膦酸水解产物，我们先使用1%链蛋白酶人工去除斑马鱼胚胎的卵膜，再对此无卵膜的胚胎进行AMEP和ADEP的暴露。结果表明，与未除卵膜时相比，各浓度AMEP和ADEP暴露组胚胎的死亡率明显下降，虽然500 mg·L-1暴露组中无卵膜胚胎死亡率相对于对照组仍有极显著差异，但从胚胎开始出现显著死亡的时段来看，无卵膜胚胎比未除卵膜胚胎有所推迟，说明AMEP和ADEP暴露引起的斑马鱼胚胎死亡，是由于影响了胚胎正常出膜而导致的，但其致毒机理仍需进一步研究。

本研究首次比较研究了多种新型DPs阻燃剂及其水解产物对斑马鱼胚胎发育的毒性效应，发现DPs可能是通过其水解产物二烷基次膦酸抑制胚胎出膜，从而产生对其的毒性效应。从水生生物的角度，为DPs阻燃剂是否能作为溴化阻燃剂和传统有机磷阻燃剂的替代品提供了一定的依据。

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Toxicity Effects of Four Kinds of Dialkyl Phosphinate Flame Retardants on Zebrafish (Daniorerio) Embryo

Chen Minjie1, Li Lisha2, Chen Fengjie2, Liu Yuchen1,*, Zhang Jie2, Liang Yong1,3,4, Liu Jiyan4

1. School of Medicine, Jianghan University, Wuhan 430056, China 2. Key Laboratory of Subtropical Agriculture & Environment, Ministry of Agriculture, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China 3. Institute of Environment and Health, Jianghan University, Wuhan 430056, China 4. Key Laboratory of Optoelectronic Chemical Materials and Devices, Ministry of Education, School of Chemical and Environmental Engineering, Jianghan University, Wuhan 430056, China

Received 30 November 2015 accepted 9 January 2016

The emerging organophosphorus flame retardants, dialkyl phosphinates (DPs), have been synthesized and used in large quantities. However, the toxicological study about them is rare. In this study, zebrafish is used as a model organism to investigate the toxicity effect of new DPs such as aluminum methylcyclohexy phosphinate (AMHP), calcium methylcyclohexyl phosphinate (CMHP), aluminum methylethyl phosphinate (AMEP) and aluminum diethyl phosphinate (ADEP) on aquatic organisms. The results showed that AMHP and CMHP had no significant toxic effects on zebrafish embryo, while high concentrations of AMEP and ADEP have a certain impact on zebrafish embryo. AMEP and ADEP of 500 mg·L-1can significantly increase the mortality of zebrafish embryo, and decrease the rate of the hatching rate. We also studied methylcyclohexy phosphinate acid (MHPA), the hydrolysate of AMHP and CMHP, and found that MHPA of 1 000 mg·L-1exposure increased zebrafish embryo mortality while decreased its hatching rate. Furthermore, we compared the effect of DPs on normal zebrafish embryo and chorion-free zebrafish embryo. The results showed that the mortality is largely decreased after removing chorion. Thus, we speculate that the toxic effects of DPs on zebrafish embryo might be caused by DP’s hydrolysate, and the chorion might be the direct target. These results provide evidence that dialkyl phosphinates could be a used as preeminent substitute for brominated flame retardants and traditional organophosphorus flame retardants.

dialkyl phosphinates; dialkyl phosphinate acid; zebrafish embryo; toxicity effects

10.7524/AJE.1673-5897.20151130009

国家自然科学基金(21407063，21277062)；武汉市晨光科技计划(2013071004010474)；环境化学和生态毒理学国家重点实验室开放基金(KF2012-18，KF2013-08)；江汉大学人才启动基金(2012031)

陈敏杰(1986-)，女，助理实验师，研究方向为环境毒理学，E-mail: chenminjie@jhun.edu.cn

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: yuchen.liu@jhun.edu.cn

2015-11-30 录用日期：2016-01-09

1673-5897(2016)2-687-06

X171.5

A

简介：刘钰晨(1982—)，女，博士，讲师，主要研究方向环境毒理学，目前已发表SCI论文10余篇。

陈敏杰, 黎丽莎, 陈冯杰, 等. 4种二烷基次膦酸盐阻燃剂对斑马鱼胚胎的毒性研究[J]. 生态毒理学报，2016, 11(2): 687-692

Chen M J, Li L S, Chen F J, et al. Toxicity effects of four kinds of dialkyl phosphinate flame retardants on zebrafish (Danio rerio) embryo [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 687-692 (in Chinese)