不同老化时间的TiO2纳米颗粒对玉米生长的影响

韩笑笑，赵建，王震宇，隋海君，徐立娜,*

1. 中国海洋大学环境科学与工程学院，青岛 266100 2. 青岛海洋科学与技术国家实验室 海洋生态与环境科学功能实验室，青岛 266071



不同老化时间的TiO2纳米颗粒对玉米生长的影响

韩笑笑1,2，赵建1,2，王震宇1,2，隋海君1,2，徐立娜1,2,*

1. 中国海洋大学环境科学与工程学院，青岛 266100 2. 青岛海洋科学与技术国家实验室 海洋生态与环境科学功能实验室，青岛 266071

为探讨老化时间对TiO2纳米颗粒(nanoparticles, NPs)生物有效性的影响，研究了不同老化时间的TiO2NPs(0～120 d)对玉米幼苗生长的影响、在玉米体内的吸收及其在植株不同部位的存在位点等。研究发现，不同浓度的TiO2NPs(1 000 mg·kg-1和2 000 mg·kg-1)加入到土壤中，对玉米幼苗干鲜重没有明显的影响，但老化时间小于60 d时，对玉米幼苗株高有一定的抑制效应，老化60 d之后，随着老化时间的继续延长，毒性逐渐降低，最后趋于稳定。老化60 d时，TiO2NPs处理的玉米幼苗根冠增大，玉米幼苗体内产生H2O2的累积。在TiO2老化土壤中生长的玉米幼苗根系和地上部均有Ti的累积，1 000 mg·kg-1的TiO2NPs在玉米幼苗根部的生物累积系数达到35.4%，在地上部为13.6%，在玉米植株体内的转运系数为0.38；通过TEM观察，TiO2NPs可以进入到玉米幼苗体内，并存在于根细胞的细胞质和叶绿体膜上，在叶片细胞的液泡和细胞核中也发现有TiO2NPs的存在。上述研究结果为客观评价TiO2NPs的生态风险提供了有用信息。

TiO2NPs；玉米幼苗；生长效应；吸收转运

随着纳米技术的飞速发展，纳米材料已广泛地应用于电子、生物医药、催化和材料等各个领域[1]。在这些纳米产品的生产和使用过程中，所产生的纳米颗粒(nanoparticles, NPs)能够通过各种途径进入环境中，其潜在的环境风险和对人类健康的负面影响引起了广泛的关注，相关研究已成为国际上的热点[2]。

目前已有大量研究表明，NPs对无脊椎动物[3]、细菌[4]、藻类[5]和鱼类[6]等均能产生毒性效应。植物是生态系统的初级生产者，在生态系统中有着重要的作用。金盛杨等[7]及Zhao等[8]的研究结果均表明金属氧化物NPs能够抑制高等植物的生长。NPs有可能进入植物体中并进行迁移转运，最终通过食物链的蓄积和放大作用，对生态系统产生危害。Wang等[9]研究发现，CuO NPs能够进入玉米植株根系中，并随着木质部从地下部向地上部运输。然而，关于NPs对植物的毒性研究多是在水环境条件下进行的。NPs也会通过多种途径进入到土壤环境中，由于土壤环境的复杂性，NPs进入土壤后会在其中产生一系列的复杂反应，其中老化时间的长短与NPs的生物有效性的高低密切相关[10]。

二氧化钛纳米颗粒(TiO2NPs)作为一种重要的金属氧化物NPs，在日化用品、抗菌材料、涂料陶瓷污水处理等领域应用广泛。开展TiO2NPs对高等植物的毒性研究对认识TiO2NPs的生态安全及食品安全具有重要意义。本实验以玉米作为受试植物，研究了不同土壤老化时间下，TiO2NPs对玉米幼苗生长效应的影响，探讨了TiO2NPs在玉米幼苗体内的吸收分布与迁移规律，并通过光学显微镜(LM)和透射电子显微镜(TEM)观察了玉米幼苗根部的形态结构变化以及TiO2NPs在玉米幼苗体内的存在位点，以期为TiO2NPs的安全评价提供理论依据。

1 材料与方法 (Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

仪器：电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS 7500，美国)，透射电子显微镜(TEM，JEM-2100，JEOL，日本)，光学显微镜(LM，Leica-DM 2500，德国)，微波消解仪(CEM-MARS 6，美国)。

试剂：活性氧检测试剂盒购买于南京建成生物工程研究所；实验用乙醇、浓硝酸、浓盐酸、戊二醛均为化学纯，购自中国国药有限公司。

1.2 实验材料

TiO2纳米颗粒(nanoparticles, NPs)和TiO2大颗粒(bulk particles, BPs)购买于美国Sigma公司，TiO2NPs平均粒径小于50 nm，BPs的平均粒径为0.2～0.4 μm，纯度均大于99.9%。

玉米种子购买于青岛市种子站的渝单8号，挑选颗粒饱满、大小均一的玉米种子用于实验。

实验所用土壤是城阳红岛的自然土壤，其基本理化性质如表1所示。

1.3 实验设计

称取一定量TiO2NPs和TiO2BPs，分别将它们均匀地洒入过2 mm筛的土壤中，充分搅拌，使TiO2NPs的最终浓度分别是1 000 mg·kg-1和2 000 mg·kg-1，TiO2BPs的最终浓度为2 000 mg·kg-1，随后分装于花盆(直径13 cm，高约为14 cm)中进行老化，待用。

土壤老化时间设置为0 d、30 d、60 d、90 d和120 d，在不同的老化时间下将玉米种子分别播种于1 000 mg·kg-1、2 000 mg·kg-1的TiO2NPs和2 000 mg·kg-1TiO2BPs处理的花盆中。玉米生长的光照与黑暗比为12 h:12 h，昼夜温度为20～25 ℃和15～20 ℃，湿度保持在60%～70%，光照强度为16 500 lux。

表1 土壤理化性质

1.4 实验方法

1.4.1 纳米材料的表征

分别称取0.2 mg TiO2NPs和TiO2BPs，将其分别分散在20 mL乙醇溶液中，保持低温水浴超声震荡30 min，用洁净的镍网蘸取少量分散好的TiO2NPs和TiO2BPs悬浮液，待自然风干后，用透射电子显微镜观察TiO2NPs和TiO2BPs的形态和粒径。

1.4.2 玉米幼苗生长的测定

玉米种子在老化的土壤中发芽长出真叶后，待幼苗生长至第5天、第10天和第15天时，分别测定玉米幼苗株高。

玉米幼苗生长至15 d，取出完整的玉米幼苗，将根系洗净，称量幼苗根系和地上部的鲜重和干重。将玉米幼苗根部近根尖部分切割长度约为1 cm小段，用光学显微镜观察根部形态的变化。

1.4.3 玉米幼苗中H2O2含量的测定

由不同老化时间下玉米幼苗株高、地上部和根部干鲜重的变化确定TiO2NPs对玉米幼苗毒性最大的浓度和老化时间，在此浓度和老化时间下，取玉米幼苗的新鲜叶片和干净根系，匀浆、离心取上清液。按照H2O2的试剂盒说明操作，在405 nm处，用酶标仪测定吸光度计算反应产物。

1.4.4 玉米幼苗中Ti含量的测定及分布

在不同的老化时间、不同浓度的TiO2NPs和TiO2BPs处理下，玉米幼苗生长至15 d时，取出完整玉米幼苗植株，清洗干净后烘干至恒重。称取0.2 g的玉米幼苗地上部和根系分别置于消解管中，每个消解管中加入6 mL浓硝酸溶液和2 mL浓盐酸溶液，用微波消解仪进行消解，用电感耦合等离子体质谱仪测定消解样品中Ti的含量。

1.4.5 TEM观察

玉米幼苗生长至15 d，在叶片近边缘部分切割面积为5 mm×5 mm的小块，根部近根尖部分切割长度约为0.5 mm的小块，将切割的小块放入磷酸缓冲液(PBS)中清洗3遍之后，在戊二醛溶液中固定过夜，PBS清洗3遍后，用锇酸固定1 h，再经清洗、逐步脱水后，用树脂进行包埋，切片后用TEM观察。

1.5 数据统计与分析

根据Lee等[11]的方法，NPs的生物可利用性可以用NPs在生物体内的生物累积系数及转运系数表示，计算方法如下：

数据采用SPSS18.0统计分析软件进行分析，用ANOVA(analysis of variance，LSD检验法)进行显著性差异分析(P < 0.05)。

2 结果(Results)

2.1 TiO2NPs的表征

TiO2NPs和TiO2BPs悬浮液的表征结果如图1所示。TiO2NPs在TEM观察下的颗粒大小和形状，由图可见，TiO2NPs大部分接近圆形或椭圆形，粒径在20～30 nm左右；在TEM观察下TiO2BPs的颗粒大小和形状，约在0.2～0.4 μm之间，呈大块团聚状。

图1 透射电镜观察TiO2 NPs和TiO2 BPsFig. 1 TEM observation of TiO2 NPs and TiO2 BPs

2.2 不同老化时间的TiO2NPs对玉米幼苗生长的影响

2.2.1 不同老化时间的TiO2NPs对玉米幼苗株高的影响

不同老化时间下，TiO2NPs对玉米幼苗株高的影响如图2所示。相同浓度的TiO2NPs加入土壤中后，老化60 d内的土壤对株高生长有明显的抑制效应，且TiO2NPs处理对玉米幼苗的株高的抑制效应强于TiO2BPs对玉米幼苗株高的影响；土壤老化60 d后，对株高生长的抑制效应逐渐减弱，在老化120 d的土壤中，玉米幼苗能够正常生长。

2.2.2 不同老化时间的TiO2NPs对玉米幼苗干鲜重的影响

图3是不同老化时间的TiO2NPs对玉米幼苗干鲜重的影响。由图可以看出，玉米幼苗分别在TiO2NPs和TiO2BPs老化的土壤中生长15 d后，地上部和根系的干鲜重与对照相比没有明显的变化，且不同的老化时间对玉米幼苗生长也没有明显的抑制效应。

2.2.3 玉米幼苗根冠形态的观察

光学显微镜下观察的TiO2NPs和TiO2BPs老化60 d时对玉米幼苗根部形态结构的影响如图4所

示。相比于对照处理的根冠，TiO2NPs(1 000 mg·kg-1和2 000 mg·kg-1)处理的玉米幼苗的根冠增大，且1 000 mg·kg-1的TiO2NPs处理的根冠比2 000 mg·kg-1的TiO2NPs处理的根冠大，TiO2BPs处理的玉米幼苗根冠没有明显增大。

图2 不同老化时间的TiO2 NPs对玉米幼苗(15 d)株高的影响Fig. 2 Height of maize seedlings (15 d) on different aging time of TiO2 NPs in soil

图3 不同老化时间的TiO2 NPs对玉米幼苗干鲜重的影响Fig. 3 The fresh and dry weight of maize seedlings at different aging time of TiO2 NPs in soil

图4 光镜观察TiO2 NPs、TiO2 BPs对玉米幼苗根部形态结构的影响Fig. 4 LM observation of maize seedling roots with different treatments

图5 老化60 d时玉米幼苗中H2O2含量Fig. 5 H2O2 content in maize seedling at aging 60 d

2.2.4 TiO2NPs对玉米幼苗体内H2O2含量的影响

根据不同老化时间的TiO2NPs对玉米幼苗株高的影响可知，在老化60 d时，TiO2NPs可以抑制玉米幼苗的生长，因此选用60 d时的玉米幼苗测定其体内的H2O2含量。图5是老化时间60 d时，TiO2NPs处理的玉米幼苗叶片和根中的H2O2含量。1 000 mg·kg-1的TiO2NPs可以显著增加玉米幼苗叶片和根中的H2O2含量，但对照和TiO2BPs产生的H2O2含量没有显著差异。

2.3 TiO2NPs在玉米幼苗体内的吸收分布与迁移

不同老化时间下玉米幼苗中Ti含量的分布如图6所示，未添加TiO2NPs的土壤处理，玉米幼苗地上部和根系中均未检测到Ti含量的累积，而TiO2NPs和TiO2BPs处理的玉米幼苗地上部和根部中Ti的含量明显增加，其中老化60 d时，Ti在玉米幼苗中的含量最多，1 000 mg·kg-1TiO2NPs处理的玉米幼苗地上部Ti的含量达到136.7 mg·kg-1，根系中Ti的含量达到353.9 mg·kg-1，且TiO2NPs处理的玉米幼苗比TiO2BPs处理的玉米幼苗中Ti的含量多。

通过计算TiO2NPs在玉米幼苗体内的生物累积系数和转运系数可知，TiO2NPs在玉米幼苗根部的生物累积系数是35.4%，在玉米幼苗地上部的生物累积系数是13.6%，TiO2NPs在玉米幼苗体内的转运系数是0.38。

图6 不同老化时间的玉米幼苗中Ti含量的分布Fig. 6 Ti content in maize seedlings at different aging time

图7 透射电镜观察TiO2 NPs在玉米根细胞和叶细胞中的存在位点Fig. 7 The location of TiO2 NPs in leaf cells and root cells of maize observed by TEM

2.4 TEM观察TiO2NPs在玉米幼苗体内的分布位点

用透射电镜观察TiO2NPs在玉米幼苗的根和叶细胞中的存在位点(图7)，图7-A所示为一个对照处理的玉米幼苗叶细胞，在1 000 mg·kg-1TiO2NPs处理的玉米幼苗发现有黑色颗粒物存在于叶细胞的液泡中(图7-C)和细胞核中(7-E)，图7-B所示为一个对照处理的玉米幼苗根细胞，在1 000 mg·kg-1TiO2NPs处理的幼苗根细胞的细胞核(图7-D)和叶绿体膜上(图7-F)也发现了有黑色的颗粒，且叶片和根系细胞中的黑色颗粒物在形态和粒径大小上也都符合TiO2NPs的颗粒特性。

3 讨论(Discussion)

随着纳米材料的广泛应用，越来越多的NPs进入土壤环境中，而土壤环境中NPs对农作物产生的效应直接涉及到人体健康[8]。本研究中，不同浓度的TiO2NPs加入到土壤中，虽然对玉米幼苗干鲜重没有明显的影响，但老化60 d时，对玉米幼苗株高有一定的抑制效应，随着老化时间的延长，毒性降低，最后趋于稳定。这可能是由于TiO2NPs加入土壤中后，尚未与土壤各组分结合，TiO2NPs在土壤中的移动性高，因此被玉米幼苗的可利用性高，随着时间的延长，TiO2NPs在土壤中与土壤组分结合加剧，它们在土壤中的移动性也随之降低，生物可利用性降低，对玉米幼苗造成的伤害减少[12]。另外，根冠可以对植物的根部起保护作用，当TiO2NPs作用于玉米幼苗的根部时根冠增大，以降低TiO2NPs对玉米幼苗的根部的毒害胁迫，增加植物的抗性[13]。研究中发现1 000 mg·kg-1的TiO2NPs的生物效应大于2 000 mg·kg-1的TiO2NPs，这可能是由于2 000 mg·kg-1的TiO2NPs和TiO2BPs浓度过大，易于团聚，在土壤中的移动性小于1 000 mg·kg-1的TiO2NPs，导致其生物可利用性低，从而毒性降低。

氧化胁迫是纳米材料生物毒性研究中普遍认可的机制，是造成植物生长受抑制的原因之一。王震宇等[14]研究表明，TiO2NPs能使玉米幼苗产生膜脂过氧化，从而抑制植物生长。H2O2是重要的活性氧之一，胁迫刺激可以诱导细胞内H2O2的产生和积累，继而调控植物的生长发育、逆境应答等诸多生理过程。然而，活性氧具有两面性，浓度较低时，可以作为信号分子调节植物的生理活动，浓度增高时会成为毒副产物，对植物产生危害[15]。徐立娜等[16]研究发现CuO NPs暴露下，拟南芥幼苗生长受到抑制，根系和地上部均产生H2O2的积累。本研究图5中，1 000 mg·kg-1的TiO2NPs老化60 d时玉米幼苗产生的H2O2的量与对照相比有明显增加，说明TiO2NPs能够引起玉米幼苗的氧化响应，从而影响植物生长。

NPs在植物体内的迁移转运对食物链传递和食品安全存在潜在的危害。很多研究已经表明，NPs能够进入到植物体内，并发生迁移转运。Du等[17]发现TiO2NPs能够进入到小麦的根细胞中，Lin等[18]用TEM在黑麦草根的内皮层和维管束中观察到ZnO NPs的存在。本研究在玉米根系和地上部中均检测到了高浓度的Ti的积累，同时也观察到TiO2晶体颗粒主要存在于玉米根细胞的细胞质和叶绿体膜/叶细胞的液泡和细胞核中。进一步的研究需要通过X射线能谱分析(EDS)等手段进一步探讨TiO2NPs进入细胞的方式及迁移转化规律。。

[1] 王震宇, 赵建, 李娜, 等. 人工纳米颗粒对水生生物的毒性效应及其机制研究进展[J]. 环境科学, 2010, 30(8): 1409-1418

Wang Z Y, Zhao J, Li N, et al. Review of ecotoxicity and mechanism of engineered nanoparticless to aquatic organisms [J]. Environmental Science, 2010, 30(8): 1409-1418 (in Chinese)

[2] 白伟, 张程程, 姜文君, 等. 纳米材料的环境行为及其毒理学研究进展[J]. 生态毒理学报, 2009, 4(2): 174-182

Bai W, Zhao C C, Jiang W J, et al. Progress instudies on environmental behaviors and toxicological effects of nanomaterials [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2009,4(2): 174-182 (in Chinese)

[3] Lovern S, Klaper R. Daphnia magna mortality when exposed to titanium dioxide and fullerene (C60) nanoparticles [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2006, 25: 1132-1137

[4] Jiang W, Mashayekhi H, Xing B. Bacterial toxicity comparison between nano- and micro-scaled oxide particles [J]. Environmental Pollution, 2009, 157: 1619-1625

[5] Hund-Rinke K, Simon M. Ecotoxic effect of photocatalytic active nanoparticles (TiO2) on algae and daphnia [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2006, 13: 225-232

[6] Zhao J, Wang Z, Liu X, et al. Distribution of CuO nanoparticles in juvenile carp (Cyprinus carpio) and their potential toxicity [J]. Journal of Hazardous Materials, 2011, 197: 304-310

[7] 金盛杨, 王玉军, 汪鹏, 等. 不同培养介质中纳米氧化铜对小麦毒性的影响[J]. 生态毒理学报, 2010, 5(6): 842-848

Jin S Y, Wang Y J, Wang P, et al. Influence of culture media on the phytotoxicity of CuO nanoparticles to wheat (Triticum aestivum L.) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2010, 5(6): 842-848 (in Chinese)

[8] Zhao L, Sun Y, Hernandez-Viezcas J, et al. Monitoring the environmental effects of CeO2and ZnO nanoparticles through the life cycle of corn (Zea mays. L) plants and in situ μ-XRF mapping of nutrients in kernels [J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(5): 2921-2928

[9] Wang Z, Xie X, Xing B, et al. Xylem-and phloem-based transport of CuO nanoparticles in maize (Zea mays L.) [J]. Environmental Science & Technology, 2012, 46(8): 4434-4441

[10] Pereira R, Rocha-Santos P, Antunes E, et al. Screening evaluation of the ecotoxicity and genotoxicity of soils contaminated with organic and inorganic nanoparticles: The role of aging [J]. Journal of Hazardous Materials, 2011, 194: 345-354

[11] Lee W M, An Y J, Yoon H. Toxicity and bioavailability of copper nanoparticles to the terrestrial plant mung bean (Phaseolus radiatus) and wheat (Triticum aestivum): Plant agar test for water-insoluble nanoparticles [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2008, 27(9): 1915-1921

[12] Paula S, Cornelis A, Stephen L, et al. Metal-based nanoparticles in soil: Fate, behavior and effects on soil invertebrates [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2012, 31: 1679-1692

[13] Ma Y H, Kuang L L, He X, et al. Effects of rare earth oxide nanoparticles on root elongation of plants [J]. Chemosphere, 2010, 78(3): 273-279

[14] 王震宇, 于晓莉, 高冬梅, 等. 人工合成纳米TiO2和MWCNTs对玉米生长及抗氧化系统的影响[J]. 环境科学, 2010, 31(2): 480-487

Wang Z Y, Yu X L, Gao D M, et al. Effect of nano-rutile TiO2and multiwalled carbon nanotubes on growth of maize (Zea may L.) seedlings and the relevant antioxidant response [J]. Environmental Science, 2010, 31(2): 480-487 (in Chinese)

[15] 陈花, 吴俊林, 李晓军. 叶绿体中活性氧的产生和清除机制[J]. 现代生物医学进展, 2008(8): 1979-1983

Chen H, Wu J L, Li X J. Generation and scavenging of reactive oxygen species in chloroplast [J]. Progress in Modern Biomedicine, 2008(8): 1979-1983 (in Chinese)

[16] 徐立娜, 赵建, 王震宇. CuO纳米颗粒对拟南芥叶片生长及生理特性的影响[J]. 植物生理学报, 2015, 51(6): 955-961

Xu L N, Zhao J, Wang Z Y. Effect of CuO nanoparticles on growth and physiological characteristics in leaf of Arabidopsis thaliana [J]. Plant Physiology Journal, 2015, 51(6): 955-961 (in Chinese)

[17] Du W C, Sun Y Y, Rong J, et al. TiO2and ZnO nanoparticles negatively affect wheat growth and soil enzyme activities in agricultural soil [J]. Journal of Environmental Monitoring, 2011, 13: 822-828

[18] Lin D H, Xing B S. Root uptake and phytotoxicity of ZnO nanoparticles [J]. Environmental Science & Technology, 2008, 42(15): 5580-5585

◆

Effect of TiO2Engineered Nanoparticles at Different Aging Times on the Growth ofZeamaysL. in Soil

Han Xiaoxiao1,2, Zhao Jian1,2, Wang Zhenyu1,2, Sui Haijun1, Xu Lina1,2,*

1. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China 2. Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China

Received 29 November 2015 accepted 25 February 2016

To investigate the effect of aging time on the biological effectiveness of TiO2nanoparticles (NPs) in soil, the growth of maize seedlings, and the uptake and location of TiO2NPs in maize seedlings in the TiO2NPs treatment (1 000 mg·kg-1and 2 000 mg·kg-1) with different aging times were studied. The results suggested that TiO2NPs at all the tested aging times (0～120 d) had no negative effects on the dry or fresh weight of maize seedlings in soil. For the height of maize seedling, significant decrease was observed when the aging time of TiO2NPs was less than 60 days. The inhibition on the height of maize seedling was decreased after aging over 60 d. After exposure to 60 d aged TiO2NPs in soil, the root cap of maize seedling was increased and H2O2was accumulated. Ti was detected in the roots and shoots of maize after TiO2NPs exposure, indicating that TiO2NPs could be taken up in maize seedlings, and then be transported from root to shoot. After exposure to 1 000 mg·kg-1TiO2for 60 d, the bioaccumulation coefficient in maize seedling root was 35.4% and 13.6% in shoot. The transfer coefficient in maize seedlings was 0.38. As observed by TEM, TiO2NPs could exist in chloroplast membrane and nucleus of root cells, and vacuoles and nucleus of leaf cells.

TiO2nanoparticles; maize seedlings; growth effect; transfer

10.7524/AJE.1673-5897.20151129002

国家自然科学基金(41073067；41120134004)

韩笑笑(1991-)，女，研究方向为污染物的环境地球化学，E-mail: x_smile901@163.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: xln1984@126.com

2015-11-29 录用日期：2016-02-25

1673-5897(2016)2-642-08

X171.5

A

简介：徐立娜(1984—)，女，环境科学博士，博士后，主要研究方向为污染物的环境地球化学。

韩笑笑, 赵建, 王震宇, 等. 不同老化时间的TiO2纳米颗粒对玉米生长的影响[J]. 生态毒理学报，2016, 11(2): 642-649

Han X X, Zhao J, Wang Z Y, et al. Effect of TiO2engineered nanoparticles at different aging times on the growth of Zea mays L. in soil [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 642-649 (in Chinese)