无核红江橙的无核成因探讨

王 平，马培恰，唐小浪，陈杰忠，吴 文，黄永敬，钟秀娟

（1. 广东省农科院果树研究所，广东 广州 510640；2. 华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642；3. 海南省农垦科学院，海南 海口 570206）

无核红江橙的无核成因探讨

王 平1，2，3，马培恰1，唐小浪1，陈杰忠2，吴 文1，黄永敬1，钟秀娟1

（1. 广东省农科院果树研究所，广东 广州 510640；2. 华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642；3. 海南省农垦科学院，海南 海口 570206）

以无核红江橙和普通有核红江橙为试验材料，对其花粉育性、成熟胚囊结构以及胚胎发育进行了研究。结果表明：（1）无核红江橙花粉出现败育的现象，花粉的生活力和发芽率显著降低，花粉的畸形率显著升高，花粉育性属于低育型。（2）无核红江橙胚囊发育是正常的，具有1个卵细胞、2个助细胞、3个反足细胞和1个中央细胞。（3）无核红江橙胚胎发育也出现败育的现象，授粉后4周胚体开始退化，授粉后6周胚乳出现退化，授粉后7周胚胎完全退化消失，最终形成无核果实。综合分析，花粉败育和胚胎败育是无核红江橙无核的主要原因。

无核红江橙；花粉育性；成熟胚囊；胚胎发育

红江橙因源于广东省廉江市红江农场而得名，具有早结、丰产、品质优良等特点，是我国与国外甜橙相媲美的橙类品种之一，深受国内外市场欢迎，但是由于种子较多降低了经济价值［1］。无核柑橘具有无核（或少核）、可食率高、口感好等多个优点［2］，国内外许多柑橘育种专家已将无核性状作为选育柑橘新品种的重要目标，近年来也选育出一些品质优良的无核（或少核）柑橘品种（系）［3-5］。目前，无核柑橘的获得途径是多样的，主要包括辐射诱变、芽变、杂交育种等方法，如通过芽变选种、实生选种、辐射育种、生物技术育种等不同方法均可获得无核椪柑［6］。按照有性生殖一般过程，引起柑橘无核的主要成因可以分为雄性不育、雌性器官不育、不亲和性、单性结实、胚胎早期败育及染色体数目等方面［7］，如张青闪等［4］研究表明花粉母细胞（PMc）减数分裂过程中染色体异常配对和分离导致了花粉出现败育，这是造成9个红江橙无核（少核）选系无核或少核的主要原因。本试验以广东省农科院果树研究所通过60Co-γ辐射所得到的无核红江橙［3，8］和普通有核红江橙为试验材料，从其花粉育性、胚囊结构、胚胎发育状况等方面进行研究，旨在探讨无核红江橙无核化的主要成因，并为其生产应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取广东省廉江市新民镇黎村柑橘园，生长健壮、生长势一致的无核红江橙〔Citrus sinensis（L.） Osbeck var. Seedless Hongjiangcheng〕和普通有核红江橙〔Citrus sinensis（L.） Osbeck var. Seedy Hongjiangcheng〕为试材，7年生，砧木为江西红橘，各选3株。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉生活力和发芽率测定 在无核红江橙和有核红江橙的盛花期，采集新鲜含苞待放的花蕾，放在干燥器中让其自然干燥。利用醋酸洋红染色法检测花粉生活力；利用培养基（1%琼脂+0.01%硼酸+10%蔗糖）镜检花粉发芽率。采用SASS8.1软件进行t检验，光学显微镜

（OLYMPUS BH-2）镜检，数码显微照相系统（OLYMPUS DP70）拍照。

1.2.2 花粉粒电镜扫描观察 采集无核红江橙和有核红江橙的新鲜花蕾置于干燥器中，让其自然散粉，用甘油冻胶封片以供光学显微镜观察，在扫描电子显微镜（FEI-XL，工作电压15 kV）下观察花粉形态结构、极轴长（P）和赤道轴长（E），计算花粉P/E值和畸形率。

1.2.3 成熟胚囊观察 取无核红江橙即将开放的花蕾，将其雌蕊固定于卡诺固定液Ⅰ（无水乙醇∶冰醋酸＝3∶1）中，置于70%乙醇中低温（4℃）保存备用。胚囊结构观察参照薛妙男等［9］的方法并作了改进。主要步骤如下：2%丙酸乙醇媒染2 d，2%丙酸乙醇+爱氏苏木精（1∶1）整染5～6 d，冲水返蓝，2.5%纤维素酶和2.5%果胶酶混合液（pH 5.5）37℃下酶解6～7 h，蒸馏水漂洗，乳酚甘油透明，光学显微镜观察，数码显微照相系统（OLYMPUS DP70）拍照。

1.2.4 胚胎发育观察 授粉后1、2、3、4、5、6、7、8周分别取幼果，置于卡诺固定液Ⅰ（无水乙醇∶冰醋酸＝3∶1）中固定24 h，浸洗后放在70%乙醇中保存备用。采用常规石蜡切片法进行观察。旋转式切片机（AO820）切片，切片厚度8 μm，光学显微镜镜检，数码显微照相系统（OLYMPUS IX70）拍照。

2 结果与分析

2.1 无核红江橙和有核红江橙的花粉育性观察2.1.1 花粉生活力和发芽率 对花粉生活力和发芽率的测定结果表明，有核红江橙的花粉生活力为80.59%、花粉发芽率为25.96%，属于高育型，而无核红江橙的花粉生活力仅为23.45%、花粉发芽率仅为3.20%，属于低育型（表1）。通过t检验表明，花粉生活力和发芽率差异性均达极显著水平。表明无核红江橙的雄配子绝大多数已经发生败育现象。

2.1.2 花粉粒形态 利用电镜对无核红江橙和有核红江橙的花粉粒进行观察，结果发现无核红江橙和有核红江橙的花粉粒群体形态差异较大，无核红江橙的绝大多数花粉粒发生了败育现象，花粉沟皱缩，整个花粉粒出现空瘪现象（图1）。通过无核红江橙和有核红江橙的正常花粉粒（P/E）和花粉畸形率进行统计分析，发现两者正常花粉粒的P/E值t检验P＞0.05，表明无核红江橙中正常发育的花粉粒的形态结构完整；无核红江橙和有核红江橙的花粉畸形率分别为68.00%和19.67%，差异达到达极显著水平。可见，无核红江橙绝大多数花粉粒出现畸形败育现象，这与两者花粉生活力和发芽率的比较结果是一致的（表2）。

表1 无核红江橙和有核红江橙的花粉生活力和发芽率比较

图1 红江橙花粉粒群体形态

表2 无核红江橙和有核红江橙花粉粒形态比较

2.2 无核红江橙成熟胚囊结构观察

利用酶解法对无核红江橙成熟胚囊进行了观察，结果发现无核红江橙雌蕊中胚囊具有“八核七胞”结构（图2，封二），合点端有3个反足细胞，中间是含2个极核的中央细胞，珠孔端有1个卵细胞、2个助细胞，表明无核红江橙的成熟胚囊发育是正常的。

2.3 无核红江橙雌配子体及胚胎发育观察

利用石蜡切片法对无核红江橙雌配子和胚胎发育进行观察，结果表明无核红江橙的雌配子体发育是正常的，通常有9～10室，子房上位，每室有1个或多个倒生的胚珠。授粉后前3周，无核红江橙和有核红江橙的胚胎发育是正常的，初期两者的胚胎发育进入球形胚时期，随后由球形胚开始向心形胚转化。但至授粉后4周，无核红江橙胚胎开始出现败育现象，胚乳发育正常，形成中空结构，少数还可以看到剩余残骸（图3A，封二）；而有核红江橙胚胎发育正常，进入心形胚发育期（图3B，封二）。授粉后5周，无核红江橙随着细胞的增大和成熟，中空

结构继续增大；有核红江橙则从心形胚开始向鱼雷胚转化。授粉后6周，无核红江橙的胚乳出现退化，少部分发育快的珠被和珠柄已退化消失（图3C，封二）；而有核红江橙已进入子叶胚发育期（图3D，封二）。授粉后7、8周，无核红江橙已没有种子的痕迹，剩下大量汁囊；而有核红江橙子叶胚开始向成熟胚转化。综上所述，无核红江橙授粉后前3周胚胎发育是正常的，但到授粉后4周，胚胎出现败育现象，最终发育成无核果实。

3 结论与讨论

胚囊育性下降、花粉败育、胚胎败育是柑橘无核的三大诱因，近年来很多研究者从以上3个方面对不同柑橘品种进行了深入研究，并取得很多可喜的进展。本试验亦对无核红江橙的胚囊育性、花粉育性和胚胎发育状况进行观察和比较，发现无核红江橙的花粉育性和胚胎发育方面发生明显的变化。

植物胚囊育性降低会导致无核果实，常表现在卵细胞、极核、助细胞和反足细胞在不同时期出现退化。周心智等［10］研究发现特晚熟红桔JZT（P）-1胚珠中的胚囊原始细胞、孢原细胞等基本上败育，最终形成无核果实。Chen等［11］对广西桂林良丰无核椪柑的胚囊发育过程进行观察，发现在胚囊形成前后时期出现大量退化，这是导致良丰无核椪柑无核的主要成因。本试验结果表明，无核红江橙的成熟胚囊结构发育是正常的，在合点端有3个反足细胞，在中间有1个中央细胞（含2个极核），在珠孔端有1个卵细胞和2个助细胞，表明胚囊育性下降并不是无核红江橙无核的成因。

植物雄性不育是指雄蕊无法形成正常功能的花粉，例如花粉败育、花药中无花粉和花药不开裂等［12］。邱文明［13］对黔阳无核椪柑的无核机理进行研究，通过花粉扫描电镜观察、花粉染色、体外萌发以及人工授粉等试验，确定黔阳无核椪柑无核的原因是雄性不育和雌蕊发育异常。本试验结果表明，与有核红江橙相比，无核红江橙的花粉生活力和发芽率显著降低，花粉畸形率显著升高，三者的差异均达极显著水平；无核红江橙属于低育型，而有核红江橙属于高育型；无核红江橙的绝大多数花粉粒出现空瘪败育现象。综合分析推断，花粉败育是造成无核红江橙无核的一个重要原因，这与唐小浪等［3］的研究结果是一致的。

胚胎败育主要表现在雌雄蕊是正常的，但发生了致死遗传变异，胚胎退化消失产生无核果实；或是由于养分和激素的竞争，或胚乳退化继而诱发胚胎中途败育最终导致无核。余杨等［14］对南丰蜜橘无核成因的研究表明，授粉4周后大部分合子胚发育停滞且出现败育迹象；授粉8周后部分种子的胚乳开始瓦解，到授粉16周后退化形成瘪籽。王平等［15］对无籽贡柑的无核机理研究发现，胚胎早期发生中途败育是造成无核的主要原因。本试验观察发现，无核红江橙虽属于低育型，并不能排除极少量花粉与卵细胞受精发育成胚胎，这一点在胚胎早期发育过程观察中得到印证。在无核红江橙授粉后1～3周部分胚胎发育是正常的，可看到球形胚和心形胚时期。但到授粉后4周，心形胚开始出现败育；授粉后6周胚乳退化消失；授粉后8周已经没有种子的痕迹，只剩下大量汁囊，最终形成无核果实。由此表明，胚胎败育是无核红江橙无核的另一个重要原因。目前对无核红江橙胚胎败育机理尚不清楚，有待进一步研究。

［1］ 杨生发，黄辉白. 红江橙生产与出口的危机、根源与对策［J］. 中国南方果树，1996，25（4）：18-20.

［2］ 高双成，刘征，李润植.转基因技术生产无籽果实的新策略［J］. 植物学通报，2002，19（1）：49-55.

［3］ 唐小浪，罗敏. 通过重复照射培育无核红江橙新品系［J］. 中国柑桔，1993，22 （4）：18-19.

［4］ 张青闪，何永睿，陈善春，等.红江橙无核（少核）选系的细胞遗传学初步研究［J］. 西南农业大学学报（自然科学版），2006，28（6）：937-940.

［5］ 杨志新，夏明鑫，黄再安，等. 甜橙优良枝变‘安化无核大果’冰糖橙初步研究［J］. 浙江柑

橘， 2014，31（4）：8-10.

［6］ 杨水芝，谭育莲，石雪晖，等. 无核椪柑育种研究进展［J］. 湖南农业科学，2012（17）：120-122.

［7］ 王向东，秦朝，苏静，等. 柑桔无核机理研究进展［J］. 中国南方果树，2012，41（3）：60-63.

［8］ 王平，唐小浪，马培恰，等. 辐射诱变和芽变柑橘品种（系）的AFLP分析［J］. 果树学报，2012，29（1）：130-134.

［9］ 薛妙男，陈腾土. 酶解压片分离沙田柚胚囊与胚胎发育研究［J］. 广西植物，1994，14（2）：181-184.

［10］ 周心智，尤淑芬，卞德锡，等. 特晚熟红桔JZT（P）-1胚珠败育的胚胎学研究［J］. 中国农学通报，2011，27（28）：231-234.

［11］ Chen L S，Wan S Y. Studies on cytology and embryology of Guilin Liangfeng Seedless Pockan［J］. Acta Horticulture，1995（403）：16-25.

［12］ 冯小磊，范光宇，苏旭，等. 植物雄性不育生理生化研究进展［J］. 作物杂志，2012（3）：6-11.

［13］ 邱文明. “黔阳无核”椪柑无核机理及雄性不育相关基因发掘［D］. 武汉：华中农业大学，2013.

［14］ 余杨，王微，杨晓伶，等. 南丰蜜橘无核成因的研究［J］. 园艺学报，2011，38（4）：631-636.

［15］ 王平，马培恰，唐小浪，等.“无核贡柑”无核机理［J］. 热带作物学报，2009，30（7）：965-969.

（责任编辑 杨贤智）

Study on the seedless mechanism of seedless ‘Hongjiangcheng’

WANG Ping1，2，3，MA Pei-qia1，TANG Xiao-lang1，CHEN Jie-zhong2，WU Wen1，HUANG Yong-jing1，ZHONG Xiu-juan1
（1. Institute of Fruit Tree Research，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China；2. College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；3. Hainan Agricultural Reclamation Academy of Sciences，Haikou 570206，China）

The seedless ‘Hongjiangcheng’〔Citrus sinensis（L.） Osbeck〕and seedy ‘Hongjiangcheng’ were used as materials of the experiment in the study. Their pollen viability and germinating viability，embryo sac fertility and embryonic development were studied. The results showed that，compared with the seedy ‘Hongjiangcheng’，the pollen sterility of seedless ‘Hongjiangcheng’ happened，the pollen viability and germinating viability significantly declined and rate of malformation significantly rised at the same time. The pollen viability and germinating viability of seedless ‘Hongjiangcheng’ belonged to the type of low development. The embryo sac of seedless ‘Hongjiangcheng’could fertilize normally. Mature embryo sac had one egg，two synergids，three antipodal cells and a big central cell which contained two polar nuclei. The embryonic development of seedless ‘Hongjiangcheng’ happened according to the study of a few different periods. The most embryos began to degenerate at the four weeks after pollination. The endosperms disappeared with development and maturity of cells in the six weeks after pollination. And in the seven weeks after pollination，the most embryos and endosperms disappeared and seedless fruits produced in the end. The degeneration of pollen and embryos was the mainly seedless reason for seedless ‘Hongjiangcheng’development compared with seedy ‘Hongjiangcheng’.

seedless ‘Hongjiangcheng’；pollen fertility；mature embryo sac；embryonic development

S666.4

A

1004-874X（2016）10-0064-05

2016-06-19

国家公益性行业（农业）科研专项（nyhyzx07-023）

王平（1981-），男，硕士，农艺师，E-mail：wping6419@163.com

陈杰忠（1958-），男，硕士，教授，E-mail：cjzlxb@scau.edu.cn

王平，马培恰，唐小浪，等. 无核红江橙的无核成因探讨［J］.广东农业科学，2016，43（10）：64-68.