血清长链非编码RNA CRNDE-h、GAS5检测诊断多发性骨髓瘤的价值分析

李春玲，叶 龙，陈 林，赵 松，靳凤艳，牛 丰

(吉林大学第一医院，吉林 长春130021)



血清长链非编码RNA CRNDE-h、GAS5检测诊断多发性骨髓瘤的价值分析

李春玲，叶 龙，陈 林，赵 松，靳凤艳，牛 丰*

(吉林大学第一医院，吉林 长春130021)

目的 观察和分析血清长链非编码RNA (lncRNA)CRNDE-h、GAS5检测诊断多发性骨髓瘤(MM)的价值。方法 选取60例MM患者作为病例组，选取60例健康人作为对照组，应用实时荧光PCR法对两组患者的血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相对表达量进行检测和比较。结果 观察组患者的血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相对表达量均高于对照组(t=4.359、5.446，P<0.05)，CRNDE-h低表达组和CRNDE-h高表达组患者在年龄、血钙水平、13q14.3缺失等方面的差异均有统计学意义(χ2=6.648、4.444、6.696，P<0.05)，GAS5低表达组和GAS5高表达组患者在血钙水平、13q14.3缺失等方面的差异均有统计学意义(χ2=13.611、13.125，P<0.05)；单独应用血清lncRNA CRNDE-h相对表达量检测、单独应用血清lncRNA GAS5相对表达量检测及联合应用两种血清lncRNA检测诊断MM的受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积(AUC)分别为0.734、0.782、0.792。结论 MM患者表现为血清lncRNA CRNDE-h、GAS5的高表达，而且其表达水平与患者的临床特征具有相关性，检测血清lncRNA CRNDE-h、GAS5的表达量对于诊断MM具有较高的效能，可用于MM的辅助诊断和病情评价。

长链非编码RNA；实时荧光PCR；多发性骨髓瘤；诊断

(ChinJLabDiagn,2016,20:1844)

多发性骨髓瘤(MM)是一种由骨髓中浆细胞异常增生引发的骨髓恶性疾病，也是一种不可治愈的恶性疾病。MM患者体内异常的浆细胞合成分泌了单克隆免疫球蛋白，而这种免疫球蛋白几乎没有抗感染能力，这导致了患者出现了免疫功能的降低，而在患者骨髓内聚集的异常增生的骨髓瘤细胞又引发了患者出现骨质破坏，骨的局灶性病变、软组织病变及弥漫性骨髓浸润最终可导致患者出现骨痛、骨折等症状[1，2]。MM多发于中老年人群，近年来，MM的发病率呈现出了逐渐增高的趋势而且发病年龄具有年轻化倾向。MM的首发症状多样并缺乏特异性，患者可表现为骨痛、贫血、肾功能不全、感染等，当上述首发症状中的一种较为突出时，易造成误诊或漏诊，最终导致治疗的延误[3]，特别是难治性、复发性MM患者对常规化疗方案的反应性较差，患者难以通过化疗获得生存期的实质性延长[4]。随着医学科研的不断进步，针对MM的诊断、病情评价和预后预测研究已突破了骨髓活检与影像学检查的局限，而向血清游离轻链、细胞遗传学和分子生物学检测等方向发展[5]。近年来，学术界针对MM诊断的研究方向主要集中于流式细胞术、PCR技术、血清重轻链检测及正电子发射计算机断层X线体层成像技术等新型检测技术方面[6]，而遗传学研究和分子生物学技术已逐渐成为MM诊断技术研究的前沿领域。在近年来的研究中，研究者发现，长链非编码RNA(lncRNA)能够针对正常细胞与肿瘤细胞的基因表达发挥重要的调节作用，lncRNA的异常表达与肿瘤的发生、进展密切相关，它可发挥与癌基因或抑癌基因相类似的作用，从而参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等调控过程[7]，本研究针对血清lncRNA CRNDE-h、GAS5检测诊断MM的价值进行了观察和分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2012年1月至2013年1月我院收治的60例MM患者作为病例组，纳入患者均符合国际多发性骨髓瘤工作组(IMWG，2003年)/世界卫生组织(WHO，2008年)中的MM 诊断标准，患者的肿瘤学协作组体能评分(ECOG)均低于2分，预计生存期超过3个月，入组前均未接受过抗MM治疗，排除合并有活动性传染性疾病、急慢性肝炎、其它种类恶性肿瘤、精神疾患、脑卒中、重要器官器质性病变及入组前1个月有严重创伤或手术史的患者。在纳入的患者中，男性为31例，女性为29例，年龄为33至75岁，平均为(55.6±9.2)岁。选取同期在我院接受体检的健康人60例作为对照组，纳入的研究对象均经临床检查排除恶性肿瘤及重要器官功能损害，其中，男性为33例，女性为27例，年龄为35至77岁，平均为(56.2±9.1)岁。两组研究对象的年龄、性别构成的差异均无统计学意义(P>0.05)。所有纳入研究对象均对本研究方案知情并签署知情同意书，本研究方案经我院医学伦理委员会审核通过。

1.2 观察指标和检测方法

采集两组研究对象的清晨空腹外周血标本(病例组于入院次日，对照组于体检当日)，全血自凝后4 h内首先以3 000 rpm的速度在常温下离心10 min，提取上清液后再以12 000 rpm的速度在4℃下高速离心10 min，进一步提取血清后置于-80℃冰箱中保存待测。于室温解冻后，以12 000 rpm的速度在4℃下高速离心10 min，吸取上清液200 μl，应用 miRNeasy Serum/Plasma Kit提取血清总RNA，应用NanoDrop1000Spectrophotometer测定总RNA浓度，应用内参扩增曲线判断作为RNA的质控依据。应用实时荧光定量PCR法(q-RT PCR法)定量检测血清标本中的lncRNA CRNDE-h、GAS5 相对表达量，通过查询NCBI的GEO平台设计PCR引物，以cel-miR-39为内参，引物序列见表1，q-RT PCR反应体系见表2，反应条件为：模板预变性：95℃，30 s，变性：94℃，15 s，退火及扩增：60℃，30 s，共反应45个循环，直接读取各样本中的目的lncRNA及内参的循环阈值(Ct值)，即扩增产物量达到临界阈值时所对应的循环数，△Ct为目的lncRNA的Ct 值与cel-miR-39的Ct 值的差值，以2-△△Ct表示目的lncRNA的相对表达量。

表1 目的lncRNA引物序列

1.3 统计学方法

本研究所有数据均应用SPSS 13.0统计软件包建立数据库，计量资料采用(均数±标准差)的形式表示，两组之间比较应用独立样本t检验进行处理，计数资料采用百分率的形式表示，应用卡方检验进行处理，血清目的lncRNA针对MM诊断效能的比较应用受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)进行比较，两种lncRNA联合检测的AUC的计算应用Logistic多元回归分析计算概率预测因子后绘制ROC曲线，以上统计学检验均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相对表达量的比较

观察组患者的血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相对表达量均高于对照组，两组之间的差异均有统计学意义(t=4.359、5.446，P<0.05)，见表3。

表2 q-RT PCR反应体系

表3 两组研究对象血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相对表达量的比较

2.2 MM患者血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相对表达量与其临床特征的关系

以病例组患者的血清lncRNA CRNDE-h相对表达量的均数为分组界值，将病例组分为CRNDE-h低表达组(30例)和CRNDE-h高表达组(30例)两个亚组，两个亚组患者在年龄、血钙水平、13q14.3缺失等方面的差异均有统计学意义(χ2=6.648、4.444、6.696，P<0.05)，见表4；以病例组患者的血清lncRNA GAS5相对表达量的均数为分组界值，将病例组分为GAS5低表达组(30例)和GAS5高表达组(30例)两个亚组，两个亚组患者在血钙水平、13q14.3缺失等方面的差异均有统计学意义(χ2=13.611、13.125，P<0.05)，见表5。

2.3 血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相对表达量诊断MM的价值分析

以是否MM发病为因变量，以血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相对表达量为自变量，进行Logistic多元回归分析，结果显示，MM的发病与血清lncRNA CRNDE-h相对表达量(OR=6.114)、血清lncRNA GAS5相对表达量(OR=6.566)均具有相关性(Waldχ2=4.799、11.787，P<0.05)，见表6；单独应用血清lncRNA CRNDE-h相对表达量检测、单独应用血清lncRNA GAS5相对表达量检测及联合应用两种血清lncRNA检测诊断MM的AUC分别为0.734、0.782、0.792，见表7，三种方法诊断MM的ROC曲线见图1、2、3。

表4 MM患者血清lncRNA CRNDE-h相对表达量与其临床特征的关系

表5 MM患者血清lncRNA GAS5相对表达量与其临床特征的关系

表6 MM与血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相对表达量的相关性分析

表7 MM与血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相对表达量的相关性分析

图1 单独应用血清lncRNA CRNDE-h相对表达量检测诊断MM的ROC曲线

图2 单独应用血清lncRNA GAS5相对表达量检测诊断MM的ROC曲线

图3 联合应用血清lncRNA CRNDE-h GAS5相对表达量检测诊断MM的ROC曲线

3 讨论

在人类基因组中，仅含有2万-2.5万个蛋白质编码基因，其占比不足整个基因组的2%，而剩余的内含子、基因调控序列与非编码RNA基因不编码蛋白质。而在细胞的分化与代谢的生命过程中，非编码RNA发挥着非常重要的作用。目前的研究结果显示，在人类基因中约有1万种LncRNA[8，9]。lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，由RNA聚合酶Ⅱ转录生成，长度超过microRNAs、piRNAs、snoRNAs、siRNA等其它种类的RNA，它不编码蛋白质，在转录水平、转录后、表观遗传学等水平调控基因的表达，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移过程[10]。根据lncRNA对于肿瘤作用的不同，lncRNA可分为促进肿瘤作用的lncRNA和抑制肿瘤作用的lncRNA，学术界普遍认为，lncRNA有望成为新型肿瘤诊断标志物和治疗靶点用于肿瘤诊断、治疗和复发的监测[11]。目前的临床研究显示，lncRNA在胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤的发生和发展过程中发挥着重要的作用[12]，而且lncRNA的差异性表达与肺癌等恶性肿瘤的组织类型等临床特征也具有相关性[13]。

目前，学术界研究的与恶性肿瘤相关lncRNA的种类较多，目前的研究已证实，HOTAIR等多种lncRNA在多种肿瘤中表达上调，这些lncRNA可通过与甲基化酶复合体PRC2共同作用、调控组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化、影响WIF1、PTEN、p21等基因的表达、调控Wnt、Akt、p53、细胞上皮间质化相关信号通路等信号通路的方式在肿瘤的细胞周期、凋亡、血管生成、侵袭与转移等过程中发挥重要的作用[14，15]。在对553例美国MM 患者的数据分析中，研究者发现，有9个lncRNA可影响MM患者的预后，其对应的靶基因是阿肯色研究中心所报道的70个相关基因，其中，MM 患者血清lncRNA CRNDE-h 的高表达与其无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)具有相关性，有望作为评估MM预后的重要分子标记和治疗新靶点[16]，虽然lncRNA GAS5与MM患者预后的相关性尚须进一步的证据予以支持，但相关研究已证实，lncRNA GAS5的表达水平与MM患者的临床特征具有密切的相关性，而且在其它一些恶性肿瘤的恶变组织中lncRNA GAS5的表达水平与肿瘤的大小、淋巴结转移及临床分期明显相关，因此，lncRNA GAS5也有可能对恶性肿瘤患者的预后产生影响[17]。本研究结果显示，观察组患者的血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相对表达量均高于对照组(t=4.359、5.446，P<0.05)，CRNDE-h低表达组和CRNDE-h高表达组患者在年龄、血钙水平、13q14.3缺失等方面的差异均有统计学意义(χ2=6.648、4.444、6.696，P<0.05)，GAS5低表达组和GAS5高表达组患者在血钙水平、13q14.3缺失等方面的差异均有统计学意义(χ2=13.611、13.125，P<0.05)，说明MM患者表现为外周血血清lncRNA CRNDE-h、GAS5表达水平的异常升高，而且其表达水平与患者的高钙血症、13q14.3缺失等临床特征具有相关性，可作为用于MM的辅助诊断和病情评价的血清标志物；单独应用血清lncRNA CRNDE-h相对表达量检测、单独应用血清lncRNA GAS5相对表达量检测及联合应用两种血清lncRNA检测诊断MM的AUC分别为0.734、0.782、0.792，说明应用外周血血清lncRNA CRNDE-h、GAS5表达水平检测辅助诊断MM，具有较高的诊断效能，但联合检测两种指标并不能显著提高诊断效能。

综上所述，MM患者表现为血清lncRNA CRNDE-h、GAS5的高表达，而且其表达水平与患者的临床特征具有相关性，检测血清lncRNA CRNDE-h、GAS5的表达量对于诊断MM具有较高的效能，可用于MM的辅助诊断和病情评价。

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The value of serum long non-coding RNA CRNDE-h and GAS5 in diagnosis of multiple myeloma

LIChun-ling,YELong,CHENLin,etal.

(TheFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To observe and analyze the value of serum long non-coding RNA (lncRNA) CRNDE-h and GAS5 in diagnosis of multiple myeloma (MM).Methods 60 cases of MM patients were selected as the case group and 60 cases of healthy people were selected as the control group.The real-time fluorescence PCR was applied to detect and compare the relative expression quantities of the serum lncRNA CRNDE-h,GAS5 of the patients in the two groups.Results The relative expression quantities of the serum lncRNA CRNDE-h,GAS5 of the patients in the observation group were higher than those in the control group(t=4.359,5.446,P<0.05).The differences of age,serum calcium,13q14.3 deficiency between the patients in the CRNDE-h high expression group and the CRNDE-h low expression group were statistically significant (χ2= 6.648,4.444,6.696,P<0.05).The differences of serum calcium,13q14.3 deficiency between the patients in the GAS5 high expression group and the GAS5 low expression group were statistically significant (χ2=13.611,13.125,P<0.05).The areas under receiver operating characteristic curve (ROC curve) of single detection of serum lncRNA CRNDE-h expression,single detection of serum lncRNA GAS5 expression,combined detection of the two lncRNA in diagnosis of MM were 0.734,0.782,0.792.Conclusion The patients with MM show high expressions of serum lncRNA CRNDE-h,GAS5 and the expression levels in patients are associated with the clinical characteristics of the patients.The efficiencies of detection of serum lncRNA CRNDE-h,GAS5 expression in diagnosis of MM are higher and can be applied in the diagnosis of MM and the evaluation of the disease.

long non-coding RNA;real-time fluorescent PCR;multiple myeloma;diagnosis

国家自然基金面上项目(816790)

1007-4287(2016)11-1844-05

R733.3

A

2016-02-19)

*通讯作者