扶正消癌方对乳腺癌患者癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响

柳言平 李福广 郝光军 洪 伟 熊裕民

(1 陕西省安康市中心医院普外科,安康,725000; 2 陕西省榆林市第一医院肿瘤科,榆林,719000)



扶正消癌方对乳腺癌患者癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响

柳言平1李福广1郝光军2洪 伟1熊裕民1

(1 陕西省安康市中心医院普外科,安康,725000; 2 陕西省榆林市第一医院肿瘤科,榆林,719000)

目的:探讨扶正消癌方对乳腺癌患者癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响,并研究凋亡分子机制。方法:66例乳腺癌患者随机分为对照组30例和治疗组36例,对照组患者接受化疗药物表阿霉素和环磷酰胺治疗,治疗组患者在对照组基础上加用扶正消癌方,日1剂,连服9周;2组患者治疗结束后接受手术,术中留取瘤体组织。用免疫组化法检测乳腺癌组织中Ki67、MMP2、Fas基因的表达水平,Western blotting分析凋亡分子Bax、Bcl-2的蛋白表达情况。结果:治疗组乳腺癌组织Fas阳性率明显高于对照组(P<0.05);治疗组乳腺癌组织Ki67、MMP2的阳性表达率明显低于对照组;Western blotting结果显示治疗组乳腺癌细胞Bax蛋白表达显著多于对照组,而Bcl-2蛋白表达明显少于对照组,差异比较均有统计学意义(P<0.05)。结论:扶正消癌方可抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭转移,促进癌细胞凋亡,这可能是扶正消癌方治疗乳腺癌的作用机制。

扶正消癌方;乳腺癌;Ki67;MMP2;Fas;凋亡

乳腺癌为临床常见的恶性肿瘤,发病率高,已转移,目前主要治疗方式包括外科手术、化疗、放疗和内分泌治疗等[1-3]。中西医结合治疗乳腺癌疗效显著[4-5],中药复方扶正消癌方联合西药治疗中晚期乳腺癌患者疗效满意[6],且能改善乳腺癌术后内分泌综合征症状,提高患者生活质量[7],但未见相关分子机制研究,为进一步探讨扶正消癌方治疗乳腺癌的机制,本研究观察扶正消癌方用药后对乳腺癌组织中细胞核增殖抗原ki-67、肿瘤侵袭转移促进因子MMP2及促细胞凋亡因子Fas表达的影响,还对其凋亡分子机制进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年1月至2015年6月安康市中心医院普外科收治,经组织活检及病理学检查诊断为乳腺癌的患者66例,均为女性,所有患者病理分期TNM分期≥Ⅱ期,生存期预计≥8个月,KPS评分≥60分,排除其他恶性肿瘤者,接受放疗、药物过敏者。治疗组36例,年龄30～65岁,平均年龄(48.2±9.78)岁,TNM分期:Ⅱ期9例、Ⅲ期17例、Ⅳ期10例,病理分期:浸润性导管型19例、浸润性小叶型13例、腺癌型4例,KPS评分60～71分,平均(65.87±2.24)分。对照组30例,年龄31～67岁,平均年龄(49.1±8.72)岁,TNM分期:Ⅱ期7例、Ⅲ期14例、Ⅳ期9例,病理分期:浸润性导管型16例、浸润性小叶型11例、腺癌型3例,KPS评分61～70分,平均(64.36±2.58)分。2组间患者年龄、TNM分期、病理分期及KPS评分差异比较均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 治疗方法 对照组患者仅接受化疗药物治疗,联用表阿霉素(辉瑞制药无锡有限公司生产,国药准字X20000496)和环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司生产,国药准字H32020857),表阿霉素以60 mg/m2,静脉注射,1次/周;环磷酰胺以600 mg/m2,静脉注射,1次/周,连用2周后停用1周。以3周为1个疗程,共治疗3个疗程。治疗组患者在对照组化疗药物基础上加用扶正消癌方[7],药方成分包括:熟地黄30 g、枸杞子30 g、白花蛇舌草30 g、太子参30 g、半枝莲20 g、桑椹20 g、黄芪20 g、菟丝子15 g、茯苓15 g、女贞子15 g、白术15 g、莪术15 g、蒲公英15 g、猫爪草15 g、山药15 g、三棱15 g、淫羊藿12 g,日1剂,常规水煎分2次服用,连续服用3个疗程,共9周。2组患者治疗结束后接受乳腺癌外科手术(乳房切除术或保乳术),手术时留取肿瘤标本,所有标本均经10%中性福尔马林液固定,常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋切片。

1.3 免疫组化及结果判定 采用免疫组化SP法二步操作,具体实验步骤按照试剂说明书进行,用PBS替代一抗作为阴性对照。采用双盲法观察阳性反应。以细胞被染成黄色或棕色为阳性细胞,随机选择6个高倍视野,每个视野计数400个细胞,计算阳性细胞数所占的百分比均值,当此均值>10%即为阳性表达[8]。免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司,鼠抗人MMP-2抗体购自上海太阳生物技术公司;兔抗人Ki67抗体、鼠抗人Fas抗体均购自武汉博士德生物工程公司。

1.4 Western blot检测细胞Bax、Bcl-2蛋白表达水平 收集组织,充分裂解,离心收集上清,BCA法测定蛋白浓度,按每管30 μg分装,加入上样缓冲液5 μL沸水浴高温变性,低温保存,按实验需要顺序上样、SDS-PAGE电泳,转膜,封闭,孵育一抗、二抗,显影,定影,拍照保存,用Image Pro Plus 6.0软件进行半定量分析。组织裂解液、蛋白浓度测定试剂盒、Bax与Bcl-2一抗购自南京碧云天生物技术公司,β-actin抗体、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗购自北京博奥森生物技术公司。

1.5 统计学方法 相关统计学处理使用SPSS 20.0软件,组间比较计数资料采用χ2检验,计量资料采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检测乳腺癌组织中Ki67、MMP2和Fas的表达 结果如表1所示,治疗组患者乳腺癌组织Ki67阳性率41.7%,显著低于对照组MMP2阳性率70.0%,差异有统计学意义(χ2=5.298,P=0.021);MMP2阳性率38.9%显著低于对照组阳性率76.7%,差异有统计学意义(χ2=9.481,P<0.01);但是患者乳腺癌组织中Fas阳性率61.1%则显著高于对照组阳性率33.3%,差异有统计学意义(χ2=5.053,P=0.024)。乳腺癌组织中Ki67、MMP2和Fas的免疫组化蛋白表达情况。见图1、图2、图3。

表1 Ki67、MMP2及Fas抗原检测阳性结果的比较

注：*P<0.05,与对照组比较。

图1 免疫组化法检测Ki67的细胞核表达

图2 免疫组化法检测MMP2的细胞质表达

2.2 Western blotting分析Bax、Bcl-2的蛋白表达 Western blotting结果显示,与对照组比较,治疗组患者癌组织细胞Bax蛋白表达显著上升,Bcl-2蛋白表达显著下降,差异比较均有统计学意义(t=9.325,P<0.05)。见图4。

图3 免疫组化法检测Fas的细胞质表达

图4 Western blotting检测Bax、Bcl-2蛋白表达

3 讨论

中医学认为乳腺癌发生与邪毒滞留、正气不足相关,癌毒蛰伏、正气亏虚及血瘀内阻导致乳腺癌复发转移,因此中医治疗强调扶正以祛邪、祛邪不伤正,调整机体阴阳、气血、脏腑功能的平衡,达到“养正积自消”之目的[7,9-10]。扶正消癌方以桑椹、熟地黄、菟丝子、女贞子滋补肝肾之精血;三棱、猫爪草、莪术活血散结消肿;黄芪、山药、茯苓、太子参、白术益气健脾,五脏得和,精血自生;半枝莲、白花蛇舌草、蒲公英清热解余毒;淫羊藿补肾助阳[7]。研究表明扶正消癌方临床治疗肺癌、乳腺癌、胃癌具有一定的疗效[6,11-12]。

Ki-67是增殖细胞核抗原,是可靠而全面的反应细胞群体增殖活性的客观指标,基质金属蛋白酶2(Maix Metalloproteinases2,MMP2)可降解细胞外基质,促进新生血管的形成,促进肿瘤的侵袭和转移,Fas是细胞凋亡的信号分子,以二聚体与Caspase-8结合形成死亡诱导信号复合体,最后终激活Caspase-3而导致表达Fas的靶细胞凋亡。研究表明,薏苡仁提取物康莱特通过协同新辅助化疗下调乳腺癌患者Survivin和Ki-67表达而抑制肿瘤细胞,提高肿瘤缓解率,结果说明Ki-67在乳腺癌发生发展中扮演重要角色[7,13]。本研究在化疗基础上联用扶正消癌方治疗乳腺癌患者,与对照组比较可显著下调细胞增殖抗原Ki67的阳性表达率,表明扶正消癌方抑制乳腺癌肿瘤细胞增殖。薯蓣丸方颗粒剂协助化疗可降低Ki-67的阳性表达率,有利于降低乳腺癌转移及复发[13],与本研究结果一致。

本研究结果显示,扶正消癌方可显著上调治疗组促凋亡因子Fas的阳性表达率,Fas为促凋亡基因,治疗后Fas在乳腺癌组织表达增多,凋亡促进蛋白bax表达上调,而凋亡抑制因子bcl-2表达下调,吴蕾等研究表明曲普瑞林导致的bcl-2/bax比值减小促进子宫肌瘤细胞凋亡有关[14],为本研究结论提供一定支持。研究证实基质金属蛋白酶-9(MMP-9)与乳腺癌细胞转移相关[3],本文还研究了扶正消癌方治疗乳腺癌与肿瘤侵袭转移促进因子MMP2的表达关系,结果表明,MMP2在乳腺癌组织中的阳性表达率也明显小于对照组,说明扶正消癌方可能对乳腺癌细胞的侵袭与转移具有一定的影响[15]。

综上所述,扶正消癌方通过抑制乳腺癌组织Ki67、MMP2基因表达降低人乳腺癌细胞的增殖和侵袭转移能力,还通过上调Fas、Bax基因表达及下调Bcl-2表达促进人乳腺癌细胞的凋亡,这可能是扶正消癌方治疗乳腺癌的作用机制,但还需要通过大量的试验进行进一步验证。

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(2016-05-24收稿 责任编辑：王明)

Effects of Fuzheng Xiaoai Decoction on Cell Proliferation, Invasion and Apoptosis in Tissues of Breast Cancer

Liu Yanping1, Li Fuguang1, Hao Guangjun2,Hong Wei1, Xiong Yumin1

(1DepartmentofGeneralSurgery,CentralHospitalofAnkangCityofShaanxiProvince,Ankang725000,China；2Departmentofoncology,YulinFirstHospital,ShaanxiProvince，Yulin719000，China)

Objective:To investigate the effects of Fuzheng Xiaoai Decoction on cell proliferation, invasion and apoptosis in tissues of breast cancer, and its relevant apoptotic molecular mechanisms. Methods:A total of 66 cases of breast cancer were randomly divided into the control group (30 cases) and the treatment group (36 cases). The control group received chemotherapy drugs doxorubicin and cyclophosphamide. On the basis of the control group, the treatment group were treated with Fuzheng Xiaoai Decoction once a day for nine weeks. Ki67, MMP2 and Fas protein expression levels were determined by immunohistochemical technology. The protein levels of Bax, Bcl-2 were detected by western blotting. Results:The Fas expressions of breast cancer tissues were significantly higher in treatment group than the control group (P<0.05). The Ki67, MMP2 expressions in breast cancer tissues were lower in treatment group compared with the control group (P<0.05). Results of western blotting indicated that the protein level of Bax in breast cancer tissues of the treatment group increased significantly compared with the control group, but the Bcl-2 expression level decreased significantly, the differences were statistically significant (bothP<0.05). Conclusion:Fuzheng Xiaoai Decoction can inhibit the proliferation and invasion breast cancer cells, promote the apoptosis of breast cancer cells, which may be the molecular mechanism of Fuzheng Xiaoai Decoction in the treatment of breast cancer.

Fuzheng Xiaoai Decoction; Breast cancer; Ki67; MMP2; Fas; Apoptosis

陕西省科技计划项目(编号:2013KJXX-78)

R273

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.014