披针叶黄华生物碱的毒性试验研究

李 勇，魏彦明，石雅芳

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070；2宁夏职业技术学院生命科学技术系，宁夏银川 750021；3.宁夏农业学校，宁夏银川 750021)



披针叶黄华生物碱的毒性试验研究

李 勇1,2，魏彦明1*，石雅芳3

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070；2宁夏职业技术学院生命科学技术系，宁夏银川 750021；3.宁夏农业学校，宁夏银川 750021)

通过披针叶黄华碱对小鼠毒性试验的研究，复制出喹喏里西啶类生物碱中毒病理学模型。结果表明，小鼠一次性灌服总碱200 mg/kg时，即出现急性中毒死亡，由此大致推断其LD50≤200 mg/kg；对慢性中毒小鼠的血液生化检查中发现，披针叶黄华碱可使小鼠体内血红蛋白、红细胞、白细胞数量升高,谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)含量升高，尿素氮(BUN)浓度下降; 对慢性中毒小鼠的临床病理学检查中发现，以心、肝、肺、肾实质器官的细胞变性坏死为主，尤其是以肝脏、肾脏的损伤较为严重，也说明披针叶黄华碱毒性作用的靶器官可能是肝脏和肾脏。

披针叶黄华碱；毒性；试验

披针叶黄华(Thermopsislanceolata)别名“牧马豆”，属豆科野决明属植物，广泛分布于我国的内蒙古、陕西、山西、宁夏、甘肃等地区[1]。披针叶黄华属于有毒植物，家畜采食其全草或种子后会引起中毒[2]。披针叶黄华既是一种有毒植物，同时也是一种药用植物。资料显示，在我国《中药学大辞典》中记载了披针叶黄华的3个种，宁夏中草药手册也有相关记载，西北民间常用其治疗咳嗽痰喘[3]。披针叶黄华引起家畜中毒的主要生物活性成分是生物碱。据报道[4]，此类植物富含喹喏里西啶(quinolizidine)类生物碱，地上部分的全草主要含有的生物碱是黄华碱(thermopsine)、臭豆碱(anagyrine)、阿良亭碱(argentine)、羽扇豆碱(lupanine)、金雀花碱(cytisine)等；种子部分主要为金雀花碱，其次为黄华碱、鹰爪豆碱(sparteine)、N-甲基金雀花碱(N-methylcytisine)等[3]。此类生物碱具有抗癌、抗心率失调、抗微生物、抗溃疡和升高白细胞等作用[6]。本试验通过披针叶黄华总碱对小鼠毒性的研究，复制喹喏里西啶类生物碱中毒病理模型，搞清喹喏里西啶类生物碱的毒性特点，为阐明披针叶黄华的主要有毒成分提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 披针叶黄华全草 由宁夏盐池县草原站提供并鉴定。将披针叶黄华洗净、晒干、粉碎后备用。

1.1.2 试验用药物 采用超声波辅助甲醇浸提法对披针叶黄华进行提取处理，再经酸溶解、碱处理，用氯仿萃取出得到披针叶黄华碱混合物[7]。定量称取总碱，用灭菌注射用水溶解，配制成所需浓度的药液，高温灭菌，5℃保存备用。

1.1.3 主要试剂 灭菌注射用水，石家庄四药有限公司产品；氯仿(AR)，批号20140618，天津市凯通化学试剂有限公司产品；甲醇(AR)，批号20140706，天津市化学试剂三厂产品；其余均为国产分析纯。

1.1.4 主要仪器 AR1140电子天平；回流装置，减压蒸馏装置；2XZ-2旋片式真空泵，浙江黄岩求精真空泵厂生产；RE52-05型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂生产；Db-2型不锈钢电热板，苏州威尔实验用品有限公司产品；VGT-1620QTD型超声波清洗机，深圳市兴宏业投资有限公司产品。

1.1.5 实验动物 ICR小鼠35只，体重18 g～22 g，雌雄各半，购于宁夏医科大学实验动物中心，实验动物均于室温下自由饮水采食，饲喂全价饲料。

1.2 方法

1.2.1 披针叶黄华碱对小鼠的急性毒性试验 取小鼠5只，按照200 mg/kg体重的给药剂量灌服总碱溶液，给药后观察小鼠的临症状，并记录中毒表现与死亡时间。

1.2.2 披针叶黄华碱对小鼠的慢性毒性试验 取小鼠30只，随机分成6组，每组5只。分别按75、100、125、150、175、200 mg/kg体重剂量每天灌服总碱水溶液，观察小鼠的临床表现，每7 d测量体重1次，详细记录小鼠的中毒表现和死亡时间。对于已经发生中毒死亡的小鼠立即剖检，观察主要脏器的病理表现，将其肝、肺、肾组织用100 mL/L福尔马林固定，石蜡包埋HE染色，观察组织学变化[8]。

1.2.3 血液常规指标和血清生化指标的测定 分别在试验开始前以及试验的第10、20、30、40、50、60天，每天上午进食前空腹采血，每只小鼠采血2份，1份肝素钠抗凝血，用于血常规指标测定，检测指标包括血红蛋白(HGB)、红细胞比积(HCT)、红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数。另1份静置 1 h 后以 5 000 r/min 离心15 min 分离血清，用美国 MD 公司 1800型自动血液生化仪进行血清生化指标的测定， 检测指标包括谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酸激酶(CK)、总蛋白(TP)、血清中白蛋白(ALB)、血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(CREA)、血清钙(CA)、血清磷(P)含量。以上指标均按照仪器使用说明书进行操作。

2 结果

2.1 急性毒性试验结果

通过试验观察，不同剂量的总碱对小鼠急性毒性试验的结果见表1。小鼠中毒表现为狂燥不安，神经症状明显,全身肌肉阵缩，呈犬坐姿势，无法站立, 共济失调，浑身上下抽搐, 濒死前呈现蛙跳动作。

2.2 慢性毒性试验结果

2.2.1 死亡时间与中毒症状 披针叶黄华碱对小鼠的毒性呈明显的剂量效应关系(表2)。随着给药剂量的不断增加，中毒小鼠出现死亡的时间明显提前。从开始灌服的第15天开始，F组的小鼠全部死亡，E组仅死亡1只，A至D组均无出现死亡；第30天时，A、B、C组无死亡，D死亡1只，E组全部死亡；第45天时，A组无死亡，B有1只死亡，C组有2只死亡，D组累计死亡3只；第60天时，A至F组则全部死亡。发生慢性中毒的小鼠，主要表现为全身被毛粗乱，无光泽，呆立，拱背，共济失调，无法站立，精神不振，目光呆滞，嗜睡，卧地不起，呼吸急促，犬坐姿势，濒死期甚至出现垂直跳跃等。灌服到第45天时,C、D组个别怀孕的小鼠发生了流产死胎现象。

2.2.2 血液常规指标的测定结果 小鼠血红蛋白与白细胞数量升高，与试验前比较差异显著(P<0.05)；小鼠红细胞数量升高，与试验前比较差异显著(P<0.05)，在第30天时，与试验前比较差异极显著(P<0.01)；红细胞比积(压积)的变化，与试验前后比较无显著差异(P>0.05)(表3)。

2.2.3 血清生化指标的测定结果 小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)活性升高，与试验前比较差异显著(P<0.05)；小鼠的谷草转氨酶(AST)活性、肌酸激酶(CK)明显升高，与试验前比较差异极显著(P<0.01)；小鼠血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量在试验过程中均表现差异不显著(P>0.05)(表4)。小鼠的血钙(CA)、血磷(P)浓度与试验前比较差异不显著(P>0.05)；血清中的尿素氮(BUN)浓度从第20天开始出现显著下降，与试验前比较差异极显著(P<0.01)(表5)。

表1 披针叶黄华碱对小鼠急性毒性试验结果

表2 披针叶黄华碱对小鼠慢性毒性试验结果

表3 血常规检测结果

表4 血清生化检测结果

注：“a”t检验，P<0.05。

Note:"a" shows t test,P<0.05.

表5 血清生化检测结果

注：“a”t检验，P<0.05；“b”t检验，P<0.01。

Note:"a" shows t test,P<0.05;"b" shows t test,P<0.01.

2.2.4 病理剖检结果 发生慢性中毒的死亡小鼠，其肠黏膜充血、出血明显，部分肠系膜发生脱落坏死。肝脏肿大明显，边缘钝圆，且质地变脆。肾脏肿大，颜色变浅，髓质有坏死灶。肺脏充血肿大，有大量渗出液。肠系膜淋巴结肿大。心脏体积增大，出现心包积液，且有大量纤维蛋白渗出。

2.2.5 病理组织学检查结果 肝脏：肝细胞肿大，并发生凝固性坏死。肝窦隙狭窄，中央静脉和叶下静脉、小叶间静脉多呈扩张淤血(图1和图2)。

肺脏：泡壁毛细血管和肺动脉、肺静脉扩张充血，有些肺泡内有少量红细胞,呈轻度肺出血。肺间质细胞增生、水肿明显(图3和图4)。

肾脏：肾小球血管轻度扩张充血，内皮细胞肿胀填充肾小囊。肾小管上皮细胞肿胀，管腔狭窄，上皮细胞脱落，仅留一些细胞核落入管腔，间质毛细血管充血,有的呈点状出血(图5和图6)。

心脏：心肌纤维肿胀，肌浆内出现多量红色细小颗粒，有的横纹不清，间质毛细血管充血(图7和图8)。

图1 肝小叶变成“岛屿状”(100×)

Fig.1 Liver lobule structure disordered(100×)

图2 窦状隙中充满血细胞 (400×)

Fig.2 Hyperaemia in liver sinusoids(400×)

图3 肺部充血水肿(100×)

图4 肺泡内有水肿液,肺静脉扩张充血(400×)

图5 肾小球毛细血管充血,内皮细胞肿胀 (100×)

图6 肾小管上皮细胞脱落(400×)

Fig.6 The desquamation of epithelial cells in renal tubules(400×)

图7 心肌扩张出血(100×)

Fig.7 The expanding and bleeding in myocadia(100×)

图8 心肌坏死(400×)

Fig.8 Myocardial necrosis(400×)

3 讨论

3.1 披针叶黄华碱对小鼠的急性中毒试验

据《中华本草》记载，披针叶黄华所含的生物碱对小鼠腹腔注射的LD50为1 938 mg/kg[9-10]；以静脉注射的方式对家兔垂头的剂量为603 mg/kg±73 mg/kg，对其呼吸麻痹的剂量为862 mg/kg；以静脉注射的方式对犬的垂头剂量为416 mg/kg±21 mg/kg[10-13]。本试验给小鼠一次性灌服总碱200 mg/kg时，即出现急性中毒症状，在2 min～3 min之内迅速死亡，中毒表现为狂躁不安，浑身抽搐，共济失调，濒死前呈蛙跳动作，由此可以大致推断其LD50≤200 mg/kg。

3.2 披针叶黄华碱对小鼠的慢性中毒试验

试验按75、100、125、150、175、200 mg/kg剂量给小鼠每天灌服总碱水溶液，复制了慢性中毒的模型，结果200 mg/kg剂量组的小鼠在15 d内全部死亡。其他5组的试验小鼠分别在45 d和60 d内全部死亡。临床病理学检查表明，披针叶黄华碱对小鼠血常规和血液生化指标均有不同程度的影响，可使血红蛋白含量、红细胞及白细胞数量升高；可引起谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)的含量升高，尿素氮(BUN)浓度出现显著下降。病理学检查中还发现，以心、肝、肺、肾实质器官的细胞变性坏死为主，尤其是以肝脏、肾脏的损伤较为严重，这也说明披针叶黄华碱的毒性作用的靶器官可能是肝脏和肾脏。

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Study on Toxicity of Alkaloids ofThermopsislanceolata

LI Yong1，2, WEI Yan-ming1, SHI Ya-fang3

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu，730070,China; 2.NingxiaVocationalandTechnicalCollege,Yinchun,Ningxia,750021,China; 3.AgriculturalSchoolofNingxia,Yinchun,Ningxia,750021,China)

The aim of the paper was to study the toxicity of alkaloids ofThermopsislanceolataand copy out here in quinolizidine poisoning pathology model.The results showed that mice drenched with 200 mg/kg of alkaloids fromThermopsislanceolatawere all dead.As results,LD50was less than 200 mg/kg.Blood biochemical examination of chronic intoxication in mice found that alkaloids ofThermopsislanceolataincreased HGB,RBC,WBC,ALT,AST and CK,but decreased BUN.The cells in heart,liver,kidney were appeared degeneration and necrosis,especially in liver and kidney,these two organs are the target organs.

alkaloid ofThermopsislanceolata; toxicity；test

2016-05-11

宁夏高等学校科学研究项目(NGY2016251)

李 勇(1980-),男,宁夏银川人,副教授,主要从事动物医学研究。*通讯作者

S859.87；S853.7

A

1007-5038(2016)11-0078-05