慢性噪声暴露对大鼠行为学及海马区5-HT1A受体表达的影响*

王文静 廖华 刘行 杨琨 杨希林



·实验研究·

慢性噪声暴露对大鼠行为学及海马区5-HT1A受体表达的影响*

王文静1廖华1刘行1杨琨1杨希林1

目的 观察慢性噪声暴露对大鼠行为学及其海马区5-HT1A受体(5-HT1AR)表达的影响，探讨噪声暴露对精神行为的影响及听觉系统与边缘系统的关系。方法 将18只健康成年大鼠随机分为对照组和噪声组，每组9只。对照组不予任何处理；噪声组于每天同一时间给予中心频率为4 kHz、声强为100 dB SPL的宽带白噪声持续暴露4小时，共28天。 分别于实验前1天和第28天对两组大鼠行ABR检测、糖水偏爱实验、体重和摄食量的检测，于实验前1天、第14天和第28天观察大鼠的旷场行为变化，并于第28天完成ABR测试后，快速分离大鼠海马组织，采用Western-Blot和免疫组化方法检测大鼠海马区5-HT1AR的表达。 结果 实验前1天两组ABR反应阈、体重及摄食量、糖水偏爱及旷场行为均无差异(P>0.05)；实验第28天，噪声组大鼠的ABR反应阈(69.44±4.97 dB SPL)较对照组(32.22±2.48 dB SPL)明显升高(P<0.05)；噪声组大鼠糖水偏爱程度、体重和摄食量较对照组明显降低，差异有统计学意义(均为P<0.05)；实验第14、28天噪声组的旷场行为较对照组明显减少(均为P<0.05)；噪声组大鼠海马5-HT1AR的表达较对照组明显降低(P<0.05)。 结论 慢性噪声暴露会导致大鼠海马区5-HT1AR表达下降，出现抑郁样行为学表现，提示了听觉系统与边缘系统的相关性。

噪声； 抑郁； 5-HT1AR； 海马

长期噪声暴露会导致听力损失、耳鸣、听觉过敏等听觉系统问题及非听觉系统反应，如：心理压力增加、紧张、失眠、抑郁及焦虑等负面情绪，随着噪声暴露时间和强度的增加，暴露者的学习及认知能力下降[1]。急、慢性噪声暴露已成为常用的耳鸣造模方法，早期Jastreboff[2]曾分析了边缘系统在耳鸣发展中的作用，但慢性噪声暴露对外周及中枢系统的具体作用机制仍不明确。

5-HT神经元广泛分布于大脑皮层和边缘系统，主要参与多种生理功能如情绪和体温调控、心血管活动和胃肠功能等活动的调节。5-HT作为一种抑制性神经递质，大量存在于大脑皮层和神经突触以调节神经活动[3]。研究[4]表明，中枢神经系统5-HT的含量变化与精神疾病相关，其受体5-HT1AR大量表达于海马，与抑郁症和情绪及认知障碍关系密切。关于慢性噪声暴露是否会引起实验动物抑郁样行为及5-HT1AR表达变化的研究较少，本研究拟构造慢性噪声暴露大鼠模型，观察与情绪相关行为学变化并检测其海马区5-HT1AR的表达，探讨慢性噪声暴露与情绪的关系，以进一步揭示听觉系统与边缘系统的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 18只健康成年雄性SPF级大鼠(由武汉大学实验动物中心提供)，体重180～220 g，耳廓反射灵敏，无强噪声暴露史及耳毒性药物使用史。适应性喂养一周后，随机分为对照组和噪声组，每组9只，对照组不予任何处理，正常喂养28天；噪声组于每天同一时间给予中心频率为4 kHz、强度为100 dB SPL的宽带白噪声持续暴露4小时，共28天。

1.2 行为学检测 于实验前1天和第28天分别观察大鼠行为学变化，观察其有无抑郁样行为学改变。

1.2.1 体重及摄食量变化 在实验第28天称取各组大鼠的体重及24 h摄食量，分别减去实验前1天的体重及摄食量，获得大鼠体重与摄食量改变。

1.2.2 糖水偏爱实验 参照文献[5]方法，实验前，每组大鼠分别给予两瓶1%蔗糖水，训练其饮用蔗糖水24 h；禁食水24 h，再每只大鼠同时给予一瓶1%蔗糖水和一瓶纯净水饮用1 h，然后每只大鼠称重，记录其糖水及纯水消耗量并计算糖水偏爱，糖水偏爱=糖水消耗/(糖水消耗+纯水消耗)×100%。

1.2.3 旷场实验 在造模前1天、第14天和第28天进行旷场实验。旷场行为观察是在安静和四周封闭的环境下观测大鼠各项水平和垂直活动，以评估实验动物是否处于抑郁状态。参照文献[5]方法，自制大小为120 cm×90 cm×35 cm的旷场，底部和四周均为黑色，于光线与环境均适宜的环境下，使用动物行为自动跟踪系统(Ethovision3.0，荷兰)记录并分析各组大鼠在10 min内的总行程、理毛次数、直立次数和中央格停留时间等各项指标。每只大鼠检测开始时置于中央格，结束后用75%的酒精彻底消毒旷场后再进行下一只检测。

1.3 ABR检测 分别于实验前、实验第28天对各组大鼠进行ABR检测。大鼠经2%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉后，在环境噪声<30 dB SPL的隔声屏蔽室进行ABR检测；记录电极置于两侧外耳道口与颅正中线交叉处皮下，参考电极位于同侧耳后乳突皮下，接地电极置于鼻尖正中皮下；刺激声为短声(click),单耳给声，耳机发声窗位于外耳道口1 cm处，刺激速率为21次/秒，带通滤波100～3 000 Hz,观察时程为 10 ms，叠加次数为1 024次；测试强度从110 dB SPL开始，以5 dB逐次递减，以波Ⅲ最后消失的上一强度作为ABR反应阈。

1.4 Western-Blot法检测大鼠脑海马区5-HT1AR的表达 实验第28天完成ABR检测后各组大鼠分别断头取脑，根据George Paxinos & Charles Watson大鼠立体定位图谱[6]定位大鼠海马脑区，在解剖显微镜下逐渐掀开大脑皮层后迅速完整剥离海马，整个取材过程在冰上操作。各组标本分别称重，加入适量RIPA裂解液后冰上匀浆，4 ℃ 12 000 r/min离心，取上清液BCR法检测蛋白浓度，各样品取50 μg总蛋白上样，恒压120 V，12%的SDS-PAGE凝胶电泳，染溴酚蓝跑至槽底，显示目的蛋白充分分离后，停止电泳，取出凝胶，切下目的条带，PVDF膜200 mV恒流冰上转膜70 min，配成5%脱脂奶粉的TBST 封闭液，室温封闭2 h，TBST缓冲液洗膜15 min×3次，兔抗鼠5-HT1AR一抗(1:200，Santa)稀释液4 ℃过夜。取出PVDF膜于TBST缓冲液洗膜15 min×3次，HPR标记羊抗兔二抗(1:4 000，武汉博士德生物公司)稀释液中室温摇床孵育2 h，TBST缓冲液洗膜15 min×3次,ECL发光剂曝光显影Gel Pro4.0软件进行灰度扫描分析，以GAPDH为内参,比较各组海马区5-HT1AR蛋白与GAPDH光密度比值。

1.5 免疫组化染色方法检测大鼠脑海马区5-HT1AR的表达 同上法取大鼠脑海马区后将组织置于冻存管-80 ℃冰箱保存备用。常规石蜡连续切片，切片厚度为5 μm，切片脱蜡水化后微波抗原修复，3%的过氧化氢滴加于切片组织上以阻断内源性过氧化物酶；室温孵育15 min,PBS冲洗5 min×3次，滴加5-HT1AR兔抗鼠一抗(1:200，Santa)，4 ℃湿盒中孵育过夜(阴性对照选用PBS代替-HT1AR兔抗鼠一抗)，滴加辣根过氧化物酶标记二抗(1:4 000，武汉博士德生物公司)，室温孵育20～30 min，PBS冲洗5 min×3次，37 ℃ DAB显色(武汉博士德生物公司)，Harris苏木精复染(Sigma)，梯度乙醇脱水、透明、封片；显微镜下观察并采集图像，参照文献[7]方法，A：按显色细胞数记分，阳性细胞数<1/3为1分，阳性细胞数1/3～2/3为2分，阳性细胞数≥2/3为3分；B：按细胞显色深浅记分，无阳性反应细胞为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；积分数=A×B。

1.6 统计学方法 数据采用SPSS22.0统计学软件进行分析，组间比较采用T检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠ABR、体重、摄食量及糖水偏爱试验结果 造模前两组大鼠ABR反应阈、摄食量及糖水偏爱试验均无明显差异(均为P>0.05)；造模第28天，与对照组比较，噪声组大鼠ABR反应阈升高，体重增长缓慢，摄食量减少，对糖水偏爱程度降低，差异有统计学意义(均为P<0.05)(表1)。

表1 两组大鼠ABR反应阈、体重增长、摄食量改变及糖水偏爱结果比较只)

注：*与对照组同时间比较，P<0.05

2.2 两组大鼠旷场行为比较 实验前噪声组和对照组大鼠的旷场行为(总行程、理毛次数、直立次数和中央格停留时间)差异无统计学意义(均为P>0.05)；实验第14、28天，与对照组比较，噪声组在旷场环境中的总行程、理毛次数、直立次数和中央格停留时间均减少，差异有统计学意义(均为P<0.05)(表2)。

表2 两组大鼠旷场行为检测结果比较只)

注：*与对照组相应时间比较，P<0.05

2.3 两组大鼠脑海马区5-HT1AR表达的比较 实验第28天Western-Blot法检测显示，对照组与噪声组大鼠大脑海马区5-HT1AR与GAPDH的光密度比值分别为0.44和0.13(图1)；噪声组的大鼠脑海马区5-HT1AR免疫组化评分(1.78±0.92)低于对照组(4.67±0.94)(P<0.05)(图2)。可见噪声组大鼠海马区5-HT1AR的表达较对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

研究[8]显示，丘脑背内侧核的部分纤维投射至边缘系统的杏仁核，而海马和杏仁核也有部分纤维投射至听皮层，说明边缘系统和听觉中枢具有生理结构上的关联。海马作为边缘系统的重要结构，可调节下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴,在空间学习和记忆与情绪调节中发挥了重要作用。Cheng等[9]发现非听觉传导系统中的海马比听皮层更易受到噪声暴露的影响；噪声暴露可导致耳鸣，改变海马旁细胞的应答，并削弱海马的神经元细胞形成[10]；有研究[11]表明海马神经元细胞形成减少会导致海马对HPA轴的抑制降低，从而加剧抑郁、焦虑等情绪。以往研究[12]发现，慢性噪声暴露可导致海马脑区胰岛素样生长因子-1表达增加，因此推测，慢性噪声暴露导致的情绪问题可能与噪声致海马的异常结构与神经递质失衡有关。在动物实验中，常以旷场实验、体重和摄食量改变及糖水偏爱实验来评价实验动物是否处于抑郁焦虑状态[5]，故本研究通过观察长期噪声暴露后大鼠的相关行为学改变来验证大鼠是否处于抑郁状态，结果显示：噪声组大鼠较对照组大鼠的体重增长减缓、摄食量减少，糖水偏爱减少，在规定时间的水平及垂直活动减少，说明慢性噪声暴露后大鼠快感缺失，对幸福事件的反应能力降低，从而处于抑郁状态，进一步验证了听觉系统与边缘系统的关联。

图1 实验第28天Western-Blot法检测两组大鼠

图2 实验第28天免疫组化染色显示两组大鼠脑海马区

5-羟色胺 (5-HT)又称为血清素，其既是重要的单胺类神经递质，又是一种血管活性物质，广泛分布于中枢神经系统，它参与调控人体的多种生理活动和行为功能，如：情感、认知、感觉及内分泌等功能[3]。5-HT可通过不同的受体实现各种功能，其在情绪调节中的作用受到越来越多的关注和研究；5-HT1A受体(5-HT1AR)作为5-HT的受体之一在抑郁症中发挥着重要作用，现普遍认为，5-HT1AR是与抑郁症关系最密切的受体之一[13]。研究[14]发现，5-HT1AR的mRNA大量表达于海马区颗粒细胞层和锥体细胞层，可能参与人和动物的空间学习和记忆。在抑郁症和焦虑症患者中5-HT1AR基因的表达会发生变化[15]；Mori等[16]研究发现，5-HT1AR的部分激动剂可以通过增加海马神经元细胞的形成来治疗抑郁症等情绪障碍；神经影像学研究[17]也显示5-HT1AR在抑郁症中有着重要作用。从本研究结果看，长期噪声暴露后大鼠大脑海马的5-HT1AR表达较对照组明显降低；Le等[18]通过慢性不可预见性温和刺激使实验大鼠处于抑郁状态后，检测其大脑海马区5-HT1AR的表达下降，其他研究[11，19]在抑郁状态实验动物的大脑海马区中也得到了与本研究相似的结果。

Mahar认为[11]抑郁样行为可通过海马区5-HT系统的变化导致HPA轴的功能亢进，并加剧焦虑抑郁情绪，反过来影响5-HT系统。综合本研究结果，推测慢性噪声暴露会引起大鼠大脑海马区5-HT1AR表达下降，进而导致大鼠出现不良情绪，逐渐转变为抑郁状态。由于边缘系统中杏仁核是恐惧加工的重要脑区，而海马区与空间学习记忆相关，慢性噪声暴露可通过经典和非经典听觉传导通路使边缘系统的5-HT1AR表达异常，出现不良情绪，提示了听觉系统与边缘系统的相关性。

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(2016-05-11收稿)

(本文编辑 周涛)

The Effects of Chronic Noise Exposure on the Behavior Changes and the Expression of 5-HT1AR in the Hippocampus in Rat

Wang Wenjing, Liao Hua, Liu Xing , Yang Kun, Yang Xilin

(Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan, 430060, China)

Objective To study the behavior changes after longterm exposure of white noise and explore the expression of 5-HT1AR in the hippocampus in rat, and to explore the relationship between the noise exposure and the psychological condition in rat.Methods A total of 18 heathy SPF rats were randomly divided into two groups: the control group (without any treatment ) and the chronic noise exposure group( 100dBSPL white nosie, 4 hours per day for 28 days). Animal behaviors were observed on the day before exposure, 14 days and 28 days after onset, respectively. The rats were sacrificed after the detection, and the Western Blot and immunohistochemical test were used to detect the expression of 5-HT1AR in the hippocampus.Results The ABR thresholds of the noise group were significantly higher than control group at the 28 days after onset (P<0.05). Compared with the control group, the behaviors of noise group were markedly different (P<0.05). The expression of 5-HT1AR in the hippocampus in noise group was significantly decreased compared with control group (P<0.05).Conclusion Chronic noise exposure could induce the depression in rat, as well as the decreased expression of 5-HT1AR in the hippocampus which is intimately related to the mental. The chronic noise exposure leads to the mental disorders, which reveals the association of the auditory system and the limbic system.

Chronic noise exposure; Depression; 5-HT1AR; Hippocampus

* 国家自然科学基金青年基金(81100712)、湖北省自然科学基金面上项目资助(220100653)

王文静，女，河南人，硕士研究生，主要从事耳科和听力学研究。

廖华(Email:liaohuadoctor@163.com)

10.3969/j.issn.1006-7299.2016.06.014

时间：2016-11-2 16:18

R764.45

A

1006-7299(2016)06-0588-05

1 武汉大学人民医院耳鼻咽喉头颈外科(武汉 430060)

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20161102.1618.012.html