常见耳聋基因在大连地区语前聋患者与耳聋高危人群中的检测分析△

刘璟 牟书瑜 付敏 刘琳 崔玲 赵黎阳 柏桦 孙秀珍 别旭



·临床研究·

常见耳聋基因在大连地区语前聋患者与耳聋高危人群中的检测分析△

刘璟1牟书瑜1付敏1刘琳2崔玲2赵黎阳2柏桦2孙秀珍1别旭1

目的 分析常见耳聋基因突变在大连地区耳聋患者与耳聋高危人群中的分布。方法 应用遗传性聋基因芯片，对大连地区持残疾证的1～30岁语前聋患者770例及耳聋高危人群362例进行GJB2、GJB3、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因的9个突变位点的检测。结果 语前聋患者常见耳聋基因的携带率42.99%(331/770)高于耳聋高危人群(27.35%，99/362)；语前聋患者GJB2携带率23.51%(181/770)高于耳聋高危人群(14.09%，51/362)；语前聋患者SLC26A4携带率18.57%(143/770)高于耳聋高危人群(8.84%，32/362)(P<0.005)；语前聋患者中GJB2和SLC26A4纯和突变和复合杂合突变发生率为24.16%(186/770)，耳聋高危人群中未发现纯和突变和复合杂合突变；耳聋高危人群mtDNA 12SrRNA的携带率3.87% (14/362)明显高于语前聋患者(0.91%，7/770)(P<0.005)。耳聋高危人群中发现GJB3基因突变携带者2例(0.55%，2/362)。结论 SLC26A4、GJB2纯合及复合杂合基因突变携带是导致大连地区1～30岁持残疾证的语前聋患者发病的主要致聋基因。

耳聋； GJB2基因； SLC26A4基因； 线粒体12SrRNA基因

耳聋是人类最常见的感觉缺陷，其发生率是出生人口的1/500，影响了全世界2.78亿人口的正常生活[1]。在我国每年有30 000个先天性听力损失的婴儿出生，在语前聋患者中，60%为遗传性耳聋。自从1997年Kelsell发现第一个人类耳聋基因[2]，先天性聋作为遗传性疾病已越来越清晰，至今已经发现了接近145个耳聋基因。目前已知的非综合征型聋突变位点已经有133个，克隆的基因达40多个，博奥生物有限公司研制的耳聋基因芯片已涵盖大部分临床常见的耳聋基因，因方法简便实用而被广泛应用与临床工作中。本研究应用北京博奥生物有限公司研制的耳聋基因芯片对大连地区1～30岁的语前聋患者及耳聋高危人群(耳聋患者的三代以内近亲属)进行检测，分析其耳聋基因的分布，建立耳聋基因评估平台，旨在改善对耳聋患者的临床管理，提高患者的生活质量。

1 资料与方法

1.1 研究对象 持耳聋残疾证的大连市语前聋患者770例，其中男417 例，女353例，年龄1～30岁，平均19.87±8.06岁。所有耳聋患者均为双耳感音神经性聋，均在医生指导下填写“耳聋病人信息登记”，获取耳聋相关信息，包括一般信息、耳聋发病年龄、家族史、个人史(包括耳聋前传染病史、耳毒性药物应用史、外伤史等)。

耳聋高危人群362例，为上述语前聋患者的三代以内近亲属，听力均正常；其中男161 例，女201例，年龄1～30岁，平均21.96±4.80岁。

1.2 研究方法

1.2.1 耳聋基因检测 两组受检者均接受常见耳聋基因突变检测，包括：GJB2基因的35delG、176del16、235delC和299delAT，GJB3基因的538C>T，线粒体DNA(mtDNA)12SrRNA基因的1555A>G和1494C>T，SLC26A4基因的2168A>G和IVS7-2A>G。

1.2.2 DNA制备方法 用含有EDTA抗凝剂的采血管采集受检者4 ml外周静脉血，应用小剂量全血基因组DNA提取试剂盒(由北京天根生化科技有限公司提供)，提取步骤参照试剂盒提供的使用说明进行，并采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的纯度及浓度。

1.2.3 基因芯片检测 ①多重等位基因PCR：将针对9个突变位点的9组引物分成两个反应体系分别进行多重PCR，在每个15 μl反应体系中加入150 ng模板DNA。PCR程序：95 ℃ 15 min，96 ℃ 1 min预变性，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，共32个循环，70 ℃ 45 min，60 ℃ 10 min。在扩增过程中，参数设置使温度以0.5 ℃/s的速度从94 ℃降至55 ℃，以0.2 ℃/s的速度从55 ℃升至70 ℃。②杂交：PCR产物加热至95 ℃变性5 min，立即浸入冰水混合物中冰浴3 min。从两个不同的扩增体系管中各取2.5 μl PCR产物加入到10 μl杂交缓冲液管中，将混合液加到芯片的点样区域，加盖玻片，封闭杂交盒，然后放入50 ℃预热杂交箱中保温1 h。③洗片：在洗涤液Ⅰ中，42 ℃摇动洗涤2 min，迅速取出放入已经预热好的洗涤液Ⅱ中，摇动洗涤2 min；将芯片置入离心机中以1 200 r/min离心2 min。④扫描：使用晶芯R LuxScanTM 10K/B微阵列芯片扫描仪以90的激光扫描强度和532 nm激发波长进行芯片扫描，相应软件系统判读杂交信号并进行结果分析，对信号不清的样本，进行异地双盲法重新检测确认。

2 结果

2.1 两组对象常见耳聋基因突变位点及方式、发生例数分布 两组对象GJB2、GJB3、mtDNA 12SrRNA、SLC26A4基因突变位点及方式、发生例数见表1。

2.2 770例语前聋患者的GJB2、GJB3、mtDNA 12SrRNA、SLC26A4基因突变检测结果 770例语前聋患者中，携带基因突变者331例(42.99%，331/770)，男女间各基因突变携带率差异无统计学意义(P>0.25)，其中GJB2基因突变携带者181例(23.51%，181/770)，SLC26A4基因突变携带者143例(18.57%，143/770)，mtDNA12SrRNA线粒体基因突变携带者7例(0.91%，7/770)，GJB3基因突变携带者0例(0%，0/770)(表2)。

2.3 362例耳聋高危人群的GJB2、GJB3、mtDNA 12SrRNA、SLC26A4基因突变检测结果 362例耳聋高危人群中，携带基因突变者99例(27.35%，99/362)，男女间各基因携带率无显著差异(P>0.25)，其中GJB2基因突变携带者51例(14.09%，51/362)，SLC26A4基因突变携带者32例(8.84%，32/362)，mtDNA 12SrRNA线粒体基因突变携带者14例(3.87%，14/362)，GJB3基因突变携带者2例(0.55%，2/362)(表3)。

2.4 语前聋患者与耳聋高危人群GJB2、GJB3、mtDNA 12SrRNA、SLC26A4基因突变检出率结果比较 语前聋患者GJB2和SLC26A4基因突变携带率以及纯和突变和复合杂合突变的发生率分别为15.17%(121/770)和8.44%(65/770)，明显高于耳聋高危人群(均为0%)，耳聋高危人群中未发现纯和基因和复合杂合基因突变。语前聋患者纯和突变和复合杂合突变的发生率占基因突变携带者的56.19%(193/331)。但耳聋高危人群中mtDNA12SrRNA的携带率(3.87%)明显高于耳聋患者(0.91%)。

表1 四种常见耳聋基因序列改变方式及例数在语前聋患者与耳聋高危人群中的分布

表2 770例不同性别语前聋患者4种常见耳聋基因突变检出率(例，%)

表3 362例不同性别耳聋高危人群4种常见耳聋基因突变检出率(例，%)

3 讨论

GJB2基因突变是遗传性非综合征型聋(NSHL)的主要致病原因，目前已报道有111种突变方式[3]，其中显性突变9种，隐性突变92种，未知突变10种。GJB2突变后引起的NSHL具有明显的种族差异性，且突变复杂多样，欧美人群中GJB2基因突变最多见的为30delG或35delG的热点突变，在地中海国家和美国遗传性非综合征型聋患者中占60%～85%，而我国人群中尚未发现。戴朴等[4]对中国18个省份聋校的1 680例非综合征型聋病例GJB2基因检测，发现235delC突变的检出率较高，为18.16%。本研究中语前聋患者中GJB2基因突变检出率为23.51%(181/770)，235delC检出率最高为18.96%(146/770),与之接近；而纯和基因及复合基因携带率为15.71%(121/770)。

SLC26A4基因又称PDS基因，位于人类染色体7q31，编码含有780个氨基酸的蛋白质Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸组成，是一种跨膜蛋白。SLC26A4基因某一位点的突变导致Pendrin功能障碍，引起CI-转运障碍或内耳淋巴液流动异常，引起前庭水管扩大(enlarged vestibular aqueduct，EVA)和内淋巴管内压升高，内耳毛细胞受损和听神经萎缩，从而导致听力下降。目前报道的SLC26A4基因突变类型已达160种[5]，不同种族的人群中SLC26A4基因突变谱不同，在北欧最常见的突变是L236P、T416P和IVS8+1 G > A；在东亚IVS7-2A>G和H723R是韩国人、中国人和日本人突变频率较高的类型[6]。赵亚丽等[6]在明确诊断为前庭水管扩大的耳聋患者中发现IVS7-2A>G在所有突变中约占57.63%(102/177)。本研究中SLC26A4基因突变包括2168A>G和IVS7-2A>G，以后者为主，语前聋患者突变携带率为18.57%(143/770)，明显高于耳聋高危人群(8.84%，32/362)；大前庭水管是感音神经性聋儿童最常见的内耳畸形[7]，对SLC26A4基因突变筛查，不仅有利于大前庭水管综合征的诊断，而且有利于指导携带该基因突变的儿童行为，预防听力损失的发生。

线粒体DNA(mtDNA)是唯一存在于人细胞质中的DNA分子，是独立于细胞核染色体外的基因组，具有自我复制、转录和编码的功能，但同时受核DNA的调控，在有性生殖中，受精卵的线粒体绝大部分来自于卵子的细胞质，这一特点决定了线粒体遗传属于母系遗传。mtDNA的突变可通过母亲传给后代，后代子女中的女性可将突变的mtDNA继续传给下一代，而男性不再下传。根据线粒体病母系遗传的特点，先证者的许多母系亲属都是氨基糖苷类抗生素致聋的高危人群[8]，应绝对禁用氨基糖苷类抗生素，而男性患者的后代使用氨基糖苷类抗生素致聋的概率与正常人大致相同；这一特点也成为预防mtDNA1555G突变携带者发生药物性聋的关键。不同国家及不同人种mtDNA突变的发生率不尽相同，高加索人种突变频率为0%～28.57%，日本非综合征SNHL中A1555G突变频率为3%～8.7%[9]，我国纪育斌等[9]综合16篇文献的数据，初步得出我国非综合征型SNHL患者中A1555G突变频率为6.62%(230/3473)。本研究语前聋患者中A1555G突变频率为0.91%(7/770)，而耳聋高危人群中为3.87%(14/362)，本次研究只针对30岁以下人群，语前聋患者中的7例均有氨基糖苷类抗生素用药史，或许与上世纪80年代以来氨基糖苷类抗生素在我国得到合理应用有一定的原因。耳聋高危人群该基因突变携带率较高，因此，应进一步加强氨基糖苷类抗生素的合理应用，以降低该基因突变携带者药物性聋发生的几率。

GJB3基因即编码Cx31的基因，可以引起常染色体显性或者隐性遗传性非综合征型聋。1998年夏家辉等[10]最早报道了两个引起显性遗传高频听力下降的GJB3突变；我国各地研究中发现GJB3基因突变的发生率分别为0.56%(1/87)[11]、0.75%(1/133)[12]或更低；本研究仅在耳聋高危人群中发现GJB3基因538C>T杂合突变2例，携带者听力正常。

60%以上的耳聋是由遗传因素造成，基因缺陷与听觉传导通路的异常是耳聋发生的核心问题[13]。2013年孟培等[14]研究发现正常人群中常见耳聋基因突变携带率为4.62%(49/1 060)；本研究发现耳聋高危人群耳聋基因突变携带率高达27.35%(99/362)，因此，耳聋高危人群若能避免与相同基因突变携带者婚配，可减少后代中遗传性耳聋的发病率。

总之，本研究发现，SLC26A4、GJB2纯合及复合杂合基因突变是导致大连地区语前聋患者发病的主要致聋基因；针对mtDNA1555G基因突变携带者加强对氨基糖苷类抗生素的合理控制，可避免药物性聋的发生。基因芯片的应用使耳聋基因筛查工作更高效快捷，对耳聋患者及耳聋高危人群的基因筛查可指导其婚育[14，15]，以降低后代发生耳聋的风险，将耳聋预防的关口前移。

1 Morton CC,Nance WE.Newborn hearing screening-a silent revolution[J].N Engl J Med，2006, 354:2151.

2 Kelsell DP, Dunlop J,Stevens HP, et al. Connexin 26 mutations in hereditary non-syndromic sensorineural deafness[J].Nature，1997,387:80.

3 Kenneson A, Van Naarden Braun K, Boyle C.GJB2 (connexin 26) variants and nonsyndromic sensorineural hearing loss: A HuGE review[J]. Genetics in Medicine, 2002, 4:258.

4 戴朴,于飞,刘新，等. 18个省市聋校学生非综合征性聋病分子流行病学研究(I)[J].中华耳科学杂志，2006,4: 1.

5 AlejandraP, Silvia D, SimonaR,et al.Functional assessment of allelic variants in the SLC26A4 gene involved in Pendred syndrome and nonsyndromic EVA[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2008,105:18608.

6 赵亚丽，王秋菊，李庆忠，等. 95例前庭水管扩大核心家系SLC26A4基因特异突变图谱[J]. 听力学及言语疾病杂志，2008,16:171.

7 孙宝春,代志瑶,黄莎莎,等.GJB2、SLC26A4基因致病性突变与内耳CT表型关系的研究[J].中华耳科学杂志，2014，12：30.

8 Estivill X, Govea N, Barceló E, et al. Familial progressive sensorineural deafness is mainly due to the mtDNA A1555G mutation and is enhanced by treatment of aminoglycosides[J]. American Journal of Human Genetics, 1998, 62:27.

9 纪育斌，王秋菊，兰兰，等.国内线粒体DNA 12SrRNA A1555G 突变的流行病学文献分析[J]. 听力学及言语疾病杂志，2010,18:6.

10 Xia JH,Liu CY,Tang BS,et al.Mutations in the gene encoding gap junction protain beta-3 associated with autosomal domination hearing impairment[J].Nat Genet, 1998,20:32.

11 梁爽,孙喜斌,韩睿，等.非综合征型聋患者耳聋相关基因检测结果分析[J].听力学及言语疾病杂志，2011,19:10.

12 陈俞,玛依拉·吐地,张华，等.新疆维吾尔族与汉族非综合征性耳聋患者四个耳聋基因突变谱的筛查[J].中华检验医学杂志，2010,11:1083.

13 王秋菊.精准医学与聋病防控[J].中华耳科学杂志，2015，13:191.

14 孟培，郝冬梅，张金艳，等.正常人群中遗传性耳聋基因携带者筛查及结果分析[J].中国优生与遗传杂志，2013(7):7.

15 Abe S, Noguchi Y, Kitamura K.What do patients with hereditary deafness think of genetic studies[J]? Auris Nasus Larynx，2010,37:422.

(2016-03-07收稿)

(本文编辑 雷培香)

The Distribution of Common Deafness Genes in the Deafness Patients and the High Risk Population in Dalian

Liu Jing*, Mu Shuyu, Fu Min, Liu Lin, Cui Ling, Zhao Liyang, Bai Hua, Sun Xiuzhen, Bie Xu

(*Department of Otorhinolaryngology, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University， Dalian， 116027，China)

Objective To study the distribution of common deafness gene mutations in the deafness patients and the high risk population in Dalian, and to provide a basis for understanding the genetic causes and characteristics of the deaf.Methods A deafness gene test chip was used to examine 9 hot mutations in the GJB2, GJB3, SLC26A4 and mtDNA 12SrRNA genes in 770 cases of deafness patients and 362 cases of high risk population.Results The carrying rates of common deafness genes in the deafness patients were 42.99% (331/770) , and 27.35%(99/362) in the high risk population. The carrying rates of GJB2 in the deafness patients 23.51%(181/770)were more than that in the high risk population14.09%(51/362)(P<0.005). The carrying rates of SLC26A4 in the deafness patients of 18.57%(143/770)were higher than that in the high risk population of 8.84%(32/362)(P<0.005). The carrying rates of GJB2 and SLC26A4homozygous genes and compound heterozygous genes in the deafness patients were 24.16%(186/770). There was no cases in the high risk population. But the carrying rates of 12SrRNA mtDNA in the high risk population of 3.87% (14/362)were significantly higher than that in the deafness patients of 0.91%(7/770) (P<0.005).Only 2 cases for GJB3 gene mutation were found in the high risk population of 0.55%(2/362).Conclusion The homozygous genes and compound heterozygous genes are the major causes of the prelingual deafness in Dalian.

Deafness; GJB2 gene; SLC26A4 gene; mtDNA12SrRNA gene

△ 国家自然科学基金面上项目(11472074)、国家自然科学基金青年基金(31500764)联合资助

刘璟，女，河北人，主任医师，硕士，主要研究方向为临床耳科学与听力学。

别旭(Email: bx5581 @ sina.com)；孙秀珍(Email: sunxiuzhen001 @163.com)

10.3969/j.issn.1006-7299.2016.06.005

时间：2016-10-27 15:07

R764.44

A

1006-7299(2016)06-0545-04

1 大连医科大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科(大连 116027)； 2 大连市友谊医院耳鼻咽喉头颈外科

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20161027.1507.004.html