天然活性小分子靶标蛋白识别方法学研究进展

屠鹏飞　曾克武　廖理曦　宋小敏

[摘要]药物靶标是指人体内与药物相互作用并赋予药物效应的特定分子。作为传统中药的药效物质基础，天然活性小分子的作用机制阐明，特别是作用靶标的鉴定一直是药学研究者关注的重要课题，然而目前该领域一直未取得长足的进展。作者针对近年来在天然活性小分子靶标蛋白识别鉴定方面出现的新技术、新方法进行了总结，系统介绍了目前该领域的主流研究方法，原理以及成功案例，同时还探讨了每种方法的适用性及不同方法之间的优劣。相信该文对从事天然药物化学、药理学以及化学生物学领域的研究人员有一定的启发和借鉴作用。

[关键词]天然活性小分子；靶标蛋白；方法学；分子亲和色谱；活性蛋白质谱

天然活性小分子是新药研发的重要来源，目前有相当比例的临床用药都直接或间接来源于天然药物。然而，以往针对天然活性分子的活性研究大多集中在细胞表型变化的观测及初步的药效学指标评价上，即使是分子机制研究也大多仅关注一些经典的药理信号通路，往往忽略这些活性分子直接作用靶标的鉴定。主要原因可能在于天然活性分子的结构多样性和复杂性。例如不同科属、不同地域生长的药用植物性状差别很大，导致其所含有的活性化学成分多种多样，结构更是千差万别。由于化合物的结构直接决定着其药理活性作用，而天然活性分子的结构如此复杂，因此其可能作用的蛋白靶标非常繁多，即使是一个活性分子也可能同时作用于多个蛋白靶标，鉴定工作非常具有挑战性。另外一个原因就是天然活性分子中很大一部分化合物的结构含有多个活性位点，也就是说其中包含了多个可以成为药效团的亚结构，因此到底是哪一部分发挥了药效，其与靶标蛋白是如何作用的？这些问题均难以得到解答，或至少在技术上存在相当的难度，因此这也是制约天然活性分子靶标蛋白阐明工作的一个障碍。

目前，在探索天然活性分子的靶标蛋白方面，前人已经积累了一些经验，在此该文就当前主流的天然活性分子靶标蛋白鉴定工作进行了总结和分类，旨在为今后该领域的研究提供一些技术和方法上的借鉴。就目前的研究进展来看，天然活性小分子的靶标蛋白识别主要采用如下一些方法，各种方法互有优劣，可相互借鉴，也可综合运用。①基于分子亲和色谱技术识别天然活性小分子靶标蛋白（化学蛋白质组学）；②基于活性蛋白质谱技术识别天然活性小分子靶标蛋白；③基于活性小分子结构的计算机辅助反向寻靶技术；④基于生物物理学方法推测天然活性小分子靶标蛋白；⑤基于关键疾病信号通路识别天然活性小分子靶标蛋白；⑥其他新方法。

下面就分别对这些方法的原理和应用进行详细的论述和分析

1基于分子亲和色谱技术识别天然活性小分子靶标蛋白（化学蛋白质组学）

在目前所采用的各种靶标蛋白识别技术中，小分子亲和色谱法（small molecule affinity chromatography）是应用最为广泛的一种。目前应用该法已经识别并鉴定了包括天然活性分子在内的大量药物分子的靶标蛋白。目前的小分子亲和色谱法一般需要对活性小分子的结构进行修饰，通过化学手段引入标签分子进而将其连接到免疫亲和载体上，并进行靶标蛋白的富集和识别。标签分子主要是biotin，此外还包括荧光基团、化学反应基团、光反应基团、放射性同位素等。下面分别进行具体的介绍。

1.1通过引入biotin标签分子构建天然活性小分子免疫亲和载体biotin是一种相对分子质量为244的生物小分子，广泛分布于动植物体内。在生物学研究中，人们常利用hio-tin与avidin（亲和素）之间的稳定结合能力，对蛋白质及其他生物大分子进行标记和纯化富集等操作。目前已经发展出了一套十分成熟的biotin-avidin系统（BAS）用于活性小分子的靶标蛋白富集和识别。即通过将biotin与活性小分子进行化学共价键连接进而构建一种biotin修饰的活性小分子探针，并用于后续的靶标蛋白识别研究。该方法的优势在于，biotin与avidin之间存在天然的特异性强相互作用，因此利用avidin包被的琼脂糖（agarose）固相载体与biotin修饰的天然活性小分子之间进行反应，利用biotin与avidin的相互作用将活性小分子固定并包被在固相载体上，进而再通过活性小分子与蛋白之间的相互作用，富集和纯化到相应的靶标蛋白（图1）。

由于该法易于操作、适用面广，因此研究人员采用该法已经富集并识别到了一批新颖的药物靶标蛋白。陈国强教授课题组针对天然活性分子腺花素（adenanthin）治疗早幼粒白血病的靶标蛋白开展了深入研究，其利用腺花素分子结构中的活性羟基基团作为把手，通过在其上连接长链的biotin分子基团进而构建了biotin化腺花素探针分子（bio-adenan-thin），并据此富集到了相应的靶标蛋白为过氧化物酶（perox-iredoxin Ⅰ和peroxiredoxinⅡ，图2a）。进一步研究发现，腺花素可以通过靶向作用于peroxiredoxin Ⅰ和peroxiredoxinⅡ进而抑制其氧化活性，提升细胞内过氧化氢水平，激活ERK-C/EBPB信号通路并最终促进白血病细胞的分化，实现治疗作用。此外，腺花素还可以通过靶向作用于peroxiredoxinⅠ和peroxiredoxinⅡ诱导细胞毒性作用，进而实现抗肝癌的治疗作用。雷晓光课题组通过对天然抗炎活性分子ain-sliadimer A的结构进行修饰，在其羟基基础上引入biotin长链分子，构建了抗炎活性分子探针bio-ainsliadimer A（图2b），进而富集到了其抗炎靶标蛋白为IKB激酶（IKKa/β）。Ainsliadimer A能够选择性作用于46位半胱氨酸并与其形成共价键，进而抑制IKKα/β的活性并下调NF-κB炎症信号通路，实现抗炎作用。此外，通过构建biotin修饰的ainsliatri-mer A分子探针，该课题组还探索了其具有抗肿瘤作用的靶标蛋白PPARγ。天然产物withaferin A（WFA）具有明显的抗肿瘤和抗血管增殖活性，Mohan研究组针对WFA的分子结构合成了biotin修饰的抗肿瘤分子探针WFA--B（图2c）。通过靶标蛋白的富集和鉴定，发现WFA可以特异性结合于中间丝状体蛋白（intermediate filament protein）并共价结合于其半胱氨酸残基，进而抑制细胞微管生长，实现抗肿瘤作用。再有，从沙雷氏菌Serratia liquefaciens中提取得到的天然产物FRl77391具有良好的降血脂作用，能够降低体内甘油三酯的水平，但是其作用靶标尚不明确。研究人员通过结构改造，在其分子中引入biotin标签分子，进而构建了分子探针Biotin-FR177391（图2d），并将其包被在固相树脂上，然后通过小分子亲和色谱技术，富集并纯化到该小分子的靶标为蛋白质磷酸酶2A（phosphatase 2A，PP2A）。即FR177391可以通过抑制PP2A的活性进而调控下游的ERK信号通路，实现降血脂作用。

1.2通过与环氧基团反应构建天然活性小分子免疫亲和载体环氧活性基团是一种以环氧乙烷为基本结构的反应基团，其可以在碱性条件下与化合物分子中的羟基进行共价键结合，进而实现对小分子的结构修饰。Epoxy-activated Sepha-rose 6B beads是目前使用较为流行的一种环氧活性基团修饰的固相载体，其可以与含有羟基结构的化学小分子进行反应并将小分子键合到固相载体表面，并用于小分子靶标蛋白的富集研究.张卫东教授课题组研究了天然倍半萜内酯TJ-5的抗炎作用及靶标蛋白，其通过利用TJ-5分子结构中的活性羟基，将其与Epoxy-activated Sepharose 6B beads进行反应，形成共价键连接，进而将TJ-5分子键合到了该固相载体表面。随后利用TJ-5与靶标蛋白之间的相互作用富集并识别到了相应的靶标蛋白为泛素连接酶UbcH5（图2e）。随后研究发现，TJ-5可以通过与UbcH5的半胱氨酸活性位点之间形成共价键连接，进而抑制泛素分子与UbcH5的结合，从而抑制NV+R炎症信号通路的激活，实现抗炎作用。另外，还有学者将姜黄素（curcumin）与Epoxy-activated Sepharose 6Bheads进行反应进而得到姜黄素包被的固相载体，然后富集和纯化相应的靶标蛋白。经二维凝胶分离和MALDI/TOF/TOF质谱鉴定后发现了若干种结合蛋白，包括结构性蛋白（tubulin，actin），细胞代谢相关酶（烯醇化酶，磷酸甘油酸变位酶，果糖-1，6-二磷酸醛缩酶），以及细胞凋亡相关酶（热休克蛋白71，过氧化物酶2）

但是这些蛋白是否是姜黄素分子的特异性结合靶标蛋白还有待进一步研究。

1.3通过与其他类型基团反应构建天然活性小分子免疫亲和载体秦皮乙素（esculetin）具有较好的抗结肠癌作用，但是其作用靶标尚不明确，研究人员利用该化合物的结构中含有酚羟基的特点，使之与溴化氰活化的CNBr-Sepharose 4B发生反应，进而构建esculetin修饰的固相亲和载体。研究人员利用该载体富集到了相应的靶标蛋白为β-耳关蛋白（β-cate-nin），esculetin可能与蛋白序列中的Lys312，Gly307，Lys345和Ash387等氨基酸基团发生直接相互作用，抑制β-eatenin-Tcf络合物的形成，降低细胞存活率，进而实现抗肿瘤作用。除此之外，还有多种其他类型的亲和基质可供使用，如AffiGel，Toyopearl，AQUAFIRMUS，SG beads等，对此已有专门的文献进行了系统的分析和比较。

这里值得一提的是，在应用分子亲和色谱技术富集到相应的靶标蛋白后，目前主要通过液相质谱（LC-MS/MS）技术进行蛋白质一级序列的鉴定，也就是将富集到的蛋白样品经过凝胶电泳后进而染色，并将相应的蛋白条带切割下来进行分析。一般来讲，凝胶电泳后的蛋白样品的性质相对稳定，可在4℃避光条件下保存1个月左右。

2基于活性蛋白质谱技术识别天然活性小分子靶标蛋白

活性蛋白质谱技术（activity-based protein profiling，AB-pp）主要是利用化学合成的带有不同功能标签（荧光叠氮炔基等）的小分子探针与靶标蛋白形成共价键，进而能够在高度复杂的生物样品中标记检测分离靶标蛋白的新技术。一般来讲，ARPP中使用的小分子探针包含有一个亲电基团，其能够与靶标蛋白活性口袋附近的亲核氨基酸发生反应，进而将该蛋白从复杂的蛋白混合体系中识别并分离出来因此，小分子探针一般在结构上要包含反应基团（叠氮，炔基等），作用是使得该分子探针与蛋白结合后能够被后续加入的荧光染料固相基质等特异性的识别，进而实现荧光标记和纯化分离的目的（图3）。ARPP是目前最受关注，应用范围最广的蛋白靶标识别技术之一该技术特别适合于小分子与靶蛋白之间能形成共价键结合的情况，因此需要小分子在结构上含有能够与靶蛋白发生反应的功能性结构基团，以便于与靶蛋白之间发生反应形成共价键其中，典型的亲电基团包括：环氧基，内酯，β-内酰胺，醌类，Michael受体等。这里的Michael受体是烯键或炔键与吸电子基团共轭相连形成的官能团，该结构易于与生物活性分子中的强亲核基团（半胱氨酸的巯基）发生加成反应，进而产生相应的生物学效应。

2.1活性蛋白质谱技术（ABPP）用于活性小分子的靶标蛋白识别案例 从明日草Angelica keiskei中分离出的活性查尔酮小分子4-bydroxyderricin（4-HD）具有广泛的抗菌作用，能够明显抑制金黄色葡球菌的增殖，但是其作用机制和靶标蛋白仍不清楚。因此研究人员在其原有结构基础上，通过化学合成引入炔基结构，进而构建了小分子探针（图3a）。并通过活性蛋白质谱技术捕捉并鉴定到了4-HD的靶标蛋白为丝氨酰tRNA合成酶（seryl-tRNA synthetase，STS）。由于4-HD可以共价结合于细菌的STS上并对其进行结构修饰，从而抑制了其催化氨酰化反应的活性，干扰细菌的正常生长和复制过程，实现抗菌作用。研究人员通过在浅蓝菌素（cerule-nin）结构基础上引入长链炔基进而构建活性分子探针，用于特异性标记活细胞内的棕榈酰转移酶（palmitoyl acvltrans-ferasePATs）。结果显示，构建的分子探针能够很好的标记PATs，并用于后续的质谱研究（图3h）。该研究不仅解释了天然产物cerulenin的生物靶标，也为后续关于PATs的生物功能学研究提供了一种可靠的分子探针。寄端霉素（hy-pothemycin）是一种真菌来源的天然聚酮类化合物，其可以通过抑制体内的多种激酶进而实现抗肿瘤抗寄生虫病的作用研究人员通过在其分子结构中引入炔基进而构建分子探针（图3c），以此富集和捕捉其结合的靶标蛋白，经质谱鉴定，该蛋白为含有Cys-Asp-Xaa-Gly序列的锥虫（trypanosome kinase）系列激酶（CDXG kinases）。特别是其中的T.brucei cdc2-like kinas。1（TbCLK1）激酶，是该活性分子治疗非洲锥虫病的关键作用蛋白靶标。

2.2光亲和基团活性蛋白质谱技术（PAL-ABPP）用于分子靶标寻找案例 拉二烯内酯（pladienolide）是一种具有天然抗肿瘤活性的大环内酯类化合物，研究人员通过对其进行结构改造，在其结构中同时引入biotin标签分子和光亲和基团偶氮丙啶，构建了一种抗肿瘤光亲和分子探针（图3d）。该研究组通过光交联亲和纯化技术，让构建的光亲和分子探针与细胞内的靶标蛋白进行交联，并通过hiotin标签富集到了相应的靶标蛋白经液相质谱鉴定，该靶标蛋白为剪切因子3b（splicing factor 3b，SF3b）中的3型亚基（SAP130）。进一步研究还发现，Pladienolide可以直接作用于SAP130，进而抑制SF3b蛋白复合物的功能，降低其在细胞内对特定核酸的剪切能力，抑制肿瘤细胞增殖并实现抗肿瘤作用。另外一个比较特殊的案例是天然产物槲皮素（quercetin）的靶标蛋白识别由于槲皮素自身就具有光反应活性，因此可以自身结构为基础构建光亲和反应探针，研究人员在其酚羟基基础上通过酯化反应引入biotin标签分子，进而构建光亲和分子探针（图3e）。由于quercetin与靶标蛋白结合后，在紫外光照射下可以对蛋白进行光标记，进而捕捉靶标蛋白然后再利用quercetin上的biotin标签富集和纯化靶标蛋白，经液相质谱鉴定后共分析出多个特异性结合的靶标蛋白，包括热休克蛋白HSP70/HSP90、酪蛋白激酶2（CK2）线粒体ATP酶泛素激活酶等。

2.3基于同位素标记STLAC方法的活性小分子寻靶案例细胞培养条件下稳定同位素标记技术（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）是目前定量蛋白质组学领域中的重要方法其特别适合于分析复杂生物样品中的蛋白质表达量的变化RTT Ar技术的原理就是用天然同位素（轻型）及稳定同位素（重型）标记的氨基酸取代原有培养基中的氨基酸，细胞经6-8次传代后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中，代替原有氨基酸最后再将具有不同标记的细胞蛋白裂解液等比例混合，经凝胶电泳分离后做质谱鉴定，从而分析不同处理组细胞中蛋白表达量的变化。基于此技术，人们发现天然产物雷帕霉素（rapamycin）可以稳定5′-terminal oligopyrimidine（TOP）mRNAs编码的蛋白质，包括核糖体蛋白和延伸因子等，进而影响整个细胞的生命过程。此外基于STLAC的研究发现，（_）-aR，11S-杨梅醇（Myricanol）可以通过特异性诱导细胞内自噬通路从而促进tau蛋白的降解，清除细胞内的tau。

2.4其他方法

荧光染料转移法：天然产物marinopyr-role A具有较好的抗肿瘤活性，研究人员在其分子结构中引入带有酰基结构的荧光基团，构建了荧光亲和分子探针（图3f）。当该分子探针与靶标蛋白发生相互作用时，荧光基团中的酰基能够与蛋白中的氨基发生连接，将荧光基团转移并共价连接到蛋白上，进而对该蛋白进行荧光标记，同时释放小分子由于标记的蛋白具有荧光效应，因而可以通过凝胶电泳及荧光显色方式分离纯化该蛋白。经过鉴定，marinopy-rrole A的靶标蛋白为细胞骨架蛋白actin。

活细胞在体标记技术，即通过小分子探针对活细胞内的靶标蛋白进行动态标记和成像的技术，目前已经可以实现其基本原理是，通过在小分子结构中引入叠氮基，使小分子探针首先与靶标蛋白发生结合，进而加入具有环辛炔（cyclooctyne）基团的荧光报告分子，在活细胞内，探针上的叠氮基团与荧光报告分子上的环辛炔发生偶极环加成反应，成共价键连接，进而实现对活细胞内靶标蛋白的动态标记和成像。

1基于活性小分子结构的计算机反向寻靶技术

计算机反向寻靶技术是一种基于小分子结构特点进行反向靶标蛋白预测的方法。Pharm Mapper是一个可自由访问的在线服务器，其主要通过药效团匹配法鉴定药物分子的作用靶标。通过药效团搜寻策略，Pharm Mapper可以在数小时内完成对潜在药物靶标的搜寻。在Pharm Mapper的数据库中存储了超过7000个基于受体的药效团模型（覆盖了1 627个药物靶标信息，包括459人体靶标蛋白）。Chem Mapper是另一种基于计算机的药物分子靶标识别软件，其识别靶标的理论基础是具有相似结构的化合物可能具有相似的靶标作用方式。Chem Mapper整合了大约30万具有药理学功能注释的化合物结构以及超过300万个结构明确的化合物。Chem Mapper可用于各种化合物的药理学活性预测、药物分子_靶标相关性探索计算机虚拟筛选研究等领域。目前，我国的多家研究机构已经开展了大量的此类研究。比如北京计算中心以内部开发的靶标数据库为核心，分子对接方法为基础，研发了一套较为完整的计算机反向寻靶系统，能提供在线服务（http：∥reversedock.vslead.com/）。其靶标数据库包含了600多个靶标的7000多个活性位点信息用户只需提交小分子结构，系统即可通过小分子与活性位点的一一对接匹配，给出排名靠前的活性位点，预测小分子的潜在作用靶标。此平台的关键在于数据库的准确性，数据库靶标为疾病靶标，三维结构完整（无残基缺失），靶标的生物信息全面，包括靶标的PubMed，EC，UniProt，CAS，Drug-Rank等信息，方便用户进行后续结果分析据报道，有研究人员综合利用2种反向虚拟靶点筛选系统（idTarget和PharmMapper）对中药藏红花的抗肿瘤活性成分开展了计算机反向寻靶研究.通过虚拟对接结合能计算和打分，进而发现了苦藏花素（picrocrocin）与热休克蛋白Hsp90 alpha可发生特异性结合，其分子机制可能是苦藏花素与Hsp90-alpha ATPase的催化结构域中的若干个带电氨基酸基团发生亲核反应，从而调控了该蛋白酶的活性所致。此外，黄芩素（baicalein）具有较好的抗帕金森作用，但是其靶标蛋白不明确，研究人员利用计算机虚拟靶标筛选平台，通过数据库挖掘分子对接基于结构的药效团搜索（structure-based pharmacophore searching）以及化学相似性搜索（chemical similarity searching）等技术，找到了黄芩素的作用靶标蛋白为儿茶酚对甲基转移酶（cate-chol-O-methyltransferase，COMT）和单胺氧化酶（monoamine oxidase B，MAO-B）。研究人员进而还在NMDA诱导的SHSY5Y细胞模型上验证了黄芩素对细胞的保护作用，以及对一氧化氮和活性氧自由基的调控作用。

4基于生物物理学方法推测天然活性小分子靶标蛋白

蛋白稳定性实验是生物物理学中比较常见的一种鉴定活性小分子结合靶标蛋白的方法，其理论依据是如果活性小分子和大分子蛋白发生结合，那么由于蛋白与活性小分子结合后的络合物变得更加牢固，进而增加了蛋白的稳定性，与游离的非结合蛋白相比降解速度更慢。因此可通过测定非药物处理组与药物处理组的全蛋白谱变化，然后进行比较，从而甄别出那些药物处理前后蛋白表达量发生显著变化的蛋白，由此可初步判断其为潜在的小分子结合靶蛋白，该技术也被称为药物亲和靶标稳定性分析（drug affinity responsivetarget stability，DARTS）。最近还有一种更新颖的方法报道出来，即基于氧化速率的蛋白稳定性分析（stability of pro-teins from rates of oxidation，SPROX）。该方法是通过测定被氧化的蛋氨酸残基水平进而评估可能与小分子发生结合的潜在蛋白，如果活性小分子与某一个蛋白发生结合，则将会改变该蛋白的折叠状态，进而改变该蛋白序列中蛋氨酸上的特异性氧化反应进程，最终通过质谱得以鉴定。此类方法的一个问题是，实验中需要使用高于生理浓度的小分子化合物，有的甚至高达mmol·L^-1级别，因此其分析结果是否能够真正反映生理状态下的靶蛋白和小分子间相互作用还有待进一步考察

5基于关键疾病信号通路识别天然活性小分子靶标蛋白

很多天然活性产物的作用机制研究是源于对其药用植物本身的传统应用而开展的，即古代医书中对某个植物的药用功效记载很可能在其提取物中有所体现这样可以根据目前已知的针对该类疾病的分子信号通路入手，逐步探索该活性成分可能的作用靶标蛋白

雷公藤的传统功效包括祛风除湿通络止痛消肿止痛等，临床上用于治疗类风湿关节炎等症。雷公藤内酯（triptolide）是一种结构独特的二萜类天然活性分子，具有抗炎免疫抑制抗肿瘤等活性：但是其具体的作用靶标目前尚不清楚由于上述抗炎生物活性作用一般多与炎症转录因子的活性调控密切相关，因此基于此类猜测，约翰·霍普金斯大学的研究人员系统地研究了triptol-ide对细胞转录的不同阶段和参与每个阶段的不同功能性蛋白的调控作用。最终发现triptolide的抗炎作用分子靶标是转录因子TFIIH的XPB/ERCC3亚基。从而为triptolide的抗炎分子机制阐明提供了重要的实验信息。

6其他新方法

葡糖基杀粉蝶菌素A（ducopiericidin A，GPA）是一种由放线菌产生的能够抑制微生物的丝状伪足突起（filopodia protrusion）的天然活性成分，日本学者利用代谢组学方法研究了GPA的作用靶标蛋白。通过毛细管电泳_飞行时间质谱联用技术（CE-TOF-MS），该研究团队发现GPA能够靶向作用葡萄糖转运体进而抑制糖酵解过程，因此GPA可以作为一种糖酵解的分子探针加以使用。这是一个利用代谢组学分析方法鉴定分子靶标蛋白的优秀案例。海洋真菌次级代谢产物Xvloketal B（XKB）具有显著的抗氧化、神经保护、心肌保护作用，但是其作用的蛋白靶标及代谢调控作用尚不清楚。研究人员将咪达唑仑（midazolam）作为模型分子探针，利用生物信息学软件平台DDI-CPI（predicting drug-drug interaction via chemical-protein interactome）预测XKB的作用靶标蛋白为Cyp3a2，并采用同源建模和分子对接技术研究了XKB与靶标蛋白Cyp3a2之间的相互作用，进而通过DAVID软件（database for annotation，visualization and integrated dis-covery）分析了基于该靶标蛋白的XKB信号调控通路。结果发现了324个潜在的靶标蛋白以及62条信号通路可能被XKB所调控，同时还发现XKB可以显著下调P450 3a（Cyp3a）亚家族成员的活性和表达水平。

7总结

天然活性小分子的靶标蛋白识别是天然药物学和新药研发领域的重要课题。基于天然活性小分子可以探索并发现很多结构和功能独特的药物靶标蛋白，从而为后续基于靶标蛋白结构的创新药物设计提供关键的理论信息指导。由于天然活性小分子的结构十分多样，因此在进行靶标识别的过程中无法采用固定的一种方法，一般是综合考虑各种因素，比如：分子结构的新颖性分子的化学可修饰性分子溶解性生物活性大小等多种指标，选取一种最为合适的方法因此本文也对前述的几种方法的优劣进行了综合比较，见表1。

天然活性小分子的靶标识别可以为后续深入探索这些小分子与靶标蛋白的相互作用方式作用位点，以及分子机制研究提供关键性的指导信息，避免以往盲目地仅针对少数经典疾病信号通路开展药理研究的弊病。真正做到对活性小分子量体裁衣、无偏向性的药理机制研究。同时，由于细胞内可与小分子作用的蛋白不止一个，因此也可以通过这些技术识别与小分子发生相互作用的多个蛋白，进而评估可能的药物毒性靶标及副作用，进而全面了解药物分子的药理及毒理学机制总之，天然活性小分子的作用靶标识别是一项十分具有挑战性的工作，相关研究技术较难掌握，需要研究者的经验较为丰富，希望今后能够出现更多更加成熟且易于掌握的方法，从而使得该项研究能够在更广的范围内开展，大大推动天然药物学及新药研制的前进步伐。