地黄根际土壤不同萃取部位的化感效应研究

陈 枫，李 娟*，聂 铭，申军艳，索艳飞，王丰青，张重义

（1.河南农业大学 农学院，河南 郑州 450002；2.福建农林大学 农学院，福建 福州 350002）

地黄根际土壤不同萃取部位的化感效应研究

陈 枫1，李 娟1*，聂 铭1，申军艳1，索艳飞1，王丰青1，张重义2

（1.河南农业大学 农学院，河南 郑州 450002；2.福建农林大学 农学院，福建 福州 350002）

为研究地黄根系分泌物的化感作用，探索其中的化感物质种类和分布，以70%甲醇提取地黄茬后根际土壤，利用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分步萃取得到不同极性的部位。通过种子发芽测试和田间盆栽试验来检测和验证各部位的化感强度，利用HPLC检测各部位中的阿魏酸、香豆酸、香草酸、对羟基苯甲酸、丁香酸五种酚酸的含量。结果表明，正丁醇部和水部能抑制种子的萌发和幼根的伸长生长，化感作用效应指数分别达到-0.22和-0.43；正丁醇部对盆栽地黄块根的生长抑制作用最强，超过水部，其酚酸类总含量高达2.094μg·mL-1，主要含有香豆酸、对羟基苯甲酸和香草酸；地黄根系分泌物对种子和地黄块根的影响是不同的，需要在种子发芽试验的基础上进一步进行盆栽块根繁殖试验，才能确定某些化感物质是否是导致地黄连作障碍的化感物质。

地黄；连作障碍；化感物质；酚酸

地黄（RehmanniaglutinosaLibosch.）是玄参科地黄属多年生草本植物，主产于河南省温县、武陟、孟县、修武、沁阳、博爱等地，与怀牛膝，怀菊花，怀山药一起并称为 “四大怀药”，是我国栽培历史最早的药用植物之一［1］。地黄在种植过程中存在着严重的连作障碍。种植1年之后，需间隔8—10年才能再次种植［2-4］。张宝等［5-7］通过地黄种植前后土壤及其根系分泌物的分析对比，对地黄连作障碍的成因及消减技术进行研究。李振方等［8-9］研究认为，根系分泌物的化感自毒作用可能是导致地黄连作障碍的主要原因，其中的酚酸类物质可能是主要化感物质［10-13］。由于化感物质在土壤中的含量极低及分离提取困难等原因，目前地黄化感自毒作用的研究多数停留在种子发芽生物测试阶段［14-15］，缺乏后期田间试验的验证。为进一步明确导致地黄连作障碍的化感物质，本研究以地黄茬后土壤为试验材料，通过种子发芽生物测试和盆栽试验来研究地黄根际土壤总提取物的不同萃取部位的潜在化感效应，并利用HPLC对其各部位中的酚酸类物质进行检测，研究地黄根际土壤中化感物质的分布及作用方式，进一步揭示地黄连作障碍机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验所用土壤取自河南省温县姚庄堤北头村。茬后土为2013年地黄收获时块根附近的土壤，对照组土壤为同一区域8年内未种植过地黄的耕层土壤。供试品种为地黄温85-5，由温县农业科学研究所提供，经河南农业大学高致明教授鉴定为Rehmanniaglutinosa。

1.2 供试土样中化感物质的提取与分离

取供试土样200kg阴干，过40目 （0.42mm）筛。以70%甲醇超声提取2次，过滤、合并滤液，浓缩至膏状。水溶后以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次进行萃取，最终分别得到萃取物5.30，4.15，2.01和16.14g，以及水提物92.88g。

1.3 种子发芽生物测试

按照各萃取物在土壤中的比率分别配置母液，石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水浸提液的浓度分别为0.14，0.11，0.05，0.41和2.38mg·mL-1。

种子生物测试采用培养皿滤纸法。以萝卜种子为受试对象。试验设5个提取部位，每个提取部位设5个浓度，分别为母液浓度的0.2，1，2，3和4倍。对照组只添加蒸馏水。重复3次。灭菌后的培养皿中放入消过毒的萝卜种子30粒。每天补充1mL蒸馏水。培养条件为：白天温度25℃，时间12h，光强10000lx；夜间温度18℃，时间12h；湿度恒定。连续7d记录种子的发芽情况，并在第7天测量种子根长。计算各萃取部位对萝卜种子的化感作用效应指数（responseindex，RI）。

RI=（TR/CK-1）（TR＜CK）

RI=（1-CK/TR）（TR≥CK）

式中，TR为处理值，CK为对照值；RI＞0表示促进作用，RI＜0表示抑制作用。数据采用Excel2010和IBMSPSS19.0数据处理软件进行统计分析。

1.4 田间盆栽试验

盆栽试验于2014年6月在河南农业大学科教园区进行。试验用土为未种过地黄的土壤。种植前，将各萃取部位按照采集时地黄根际土壤中的浓度分别外源添加到地黄盆栽中。另设头茬土和重茬土作为对照。每处理重复6次。生长过程中进行常规田间管理。定期测定各处理组地黄地上部位的叶片数、叶面积、冠幅、冠幅面积等形态指标和SOD活性［16］、相对电导率［17］等生理指标，收获时测定地黄的块根鲜重、块根体积以及根系活力［18］。数据采用Excel2010和IBMSPSS19.0数据处理软件进行统计分析。

1.5 HPLC检测

1.5.1 仪器和试剂

Waters高效液相色谱仪，泵Waters1525，检测器Waters2480，Breeze色谱工作站。阿魏酸、香豆酸、香草酸、对羟基苯甲酸、丁香酸等对照品均购自ACROS公司。流动相使用的甲醇为色谱醇，水为屈臣氏蒸馏水。所有流动相均过0.22μm微孔滤膜。

1.5.2 对照品溶液和样品溶液的配制

称取对羟基苯甲酸22.45mg、香草酸22.62mg、丁香酸23.60mg、香豆酸21.31mg和阿魏酸22.55mg，分别置于5个100mL容量瓶中。用少量甲醇溶解后用高纯水定容，作为单一标样的母液。分别取10mL将其稀释100倍作为单一标样工作液。再取各单一标样的母液10mL混合后稀释100倍，作为混合标样工作液。进样前过0.22μm微孔滤膜。

分别称取石油醚部 139.00mg、氯仿部107.00mg、乙酸乙酯部 500.00mg、正丁醇部420.00mg和水部提取物2341.00mg，用蒸馏水定容至100mL，作为样品溶液。进样前过0.22μm微孔滤膜。

1.5.3 色谱条件

采用H&EAQ-C18色谱柱（4.6m×150mm，5μm），检测波长280nm，柱温20℃，进样量20μL。流动相为甲醇∶水 （20∶80），水相用冰醋酸调节pH值为2.6，流速1.0mL·min-1。

1.5.4 标准曲线的制备

分别取各单一标样工作液2，4，6，8和10mL于容量瓶，定容至10mL，摇匀。在上述色谱条件下，测定峰面积。以Y为峰面积，X为溶液浓度，求得回归方程 （表1）。

表1 5种酚酸的标准曲线

2 结果与分析

2.1 不同处理对萝卜种子发芽率和胚根长度的影响

地黄根际土壤提取物各部位对种子的发芽率和胚根的伸长生长均具有明显的影响。由表2可知，除4倍浓度之外，石油醚的各浓度均能促进萝卜种子的发芽和胚根伸长。而氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物处理对萝卜种子的发芽率和胚根长均存在明显的低促高抑现象。水组在1倍浓度时就表现出对种子发芽的抑制作用；4倍浓度时水组发芽率最小，为对照的69.7%，且对胚根伸长的抑制作用也最强；RI值为-0.43，与对照存在极显著差异。正丁醇组在2倍浓度时开始对发芽率和胚根伸长起抑制作用，4倍浓度时发芽率为对照的89%，抑制指数为-0.22，与对照存在显著差异。

2.2 盆栽地黄相关指标比较

2.2.1 地上部分生长指标

由表3可知，在出苗30d时，头茬组地黄叶片数最多，各项指标与重茬组显著差异。水和氯仿提取物各项指标与重茬地黄接近，与头茬存在显著差异。出苗60d时，头茬组地黄生长较稳定，冠幅面积 （地黄地上部分在地面的投影面积）大幅增加。重茬组的叶片数、冠幅面积都急剧减小，与头茬组存在极显著差异。各处理与头茬地黄无显著差异。出苗90d时，各组地上部分生长减慢，地上部分冠幅减小，各组差异不显著。

表2 不同处理对萝卜种子发芽率及胚根长度的影响

表3 各处理在不同时期地黄地上部分生长指标比较

2.2.2 叶片SOD活性

由表4可知，在出苗30～90d期间，头茬地黄的SOD是先增大后减小，重茬组先减小后基本保持不变，水组、正丁醇组和乙酸乙酯组 SOD一直减小。出苗30d时，重茬组SOD活性最大，正丁醇组SOD活性次之，与其他各组差异达到显著水平，水组和乙酸乙酯组的SOD大于氯仿组、石油醚组和头茬组，但差异未达到显著水平。重茬组、水组、正丁醇组和乙酸乙酯组的SOD大于头茬，这可能是该组含有的化感物质刺激了地黄的防御机制，从而使其产生大量的SOD，导致SOD显著增加。在出苗60d，头茬组地黄SOD最大，与各处理组均达到极显著差异；其他各处理组SOD均显著下降，各组间显著未达到差异水平。在出苗90d，乙酸乙酯组SOD显著降低，石油醚组显著增加，其他各组与正茬地黄无显著性差异。

表4 各处理不同时期的SOD活性比较

2.2.3 叶片相对电导率

由表5可知，在30d时，重茬组相对电导率最大，头茬相对电导率最小。水组、正丁醇组与重茬接近，差异未达到显著水平。乙酸乙酯组与水组、正丁醇组差异达到显著水平，与石油醚组、氯仿组头茬组差异达到极显著水平。这可能是由于正丁醇组、水组和乙酸乙酯组处理导致地黄细胞膜受损导致的。在60d时，石油醚组和氯仿组相对电导率最小，与其他组差异达到显著水平，其他各组差异未达到显著水平。90d时，各处理组相对电导率显著减小，与头茬和重茬差异均达到极显著水平，各处理组之间无显著差异。

表5 各处理不同时期叶片的相对电导率比较

2.2.4 收获时期的生理指标

由表6可知，在收获期，头茬地黄块根质量最大，达到44.38g。正丁醇组地黄的块根鲜重最小，为19.47g，仅为头茬地黄的43.9%，差异极显著；水组次之，其块根为25.89g，为头茬质量的58.3%，与头茬地黄存在显著差异；其他各处理组彼此差异不显著。块根体积的变化与块根鲜重基本一致。头茬地黄的根系活力最强，水组和石油醚组根系活力最弱，其中其余各组之间差异未达到显著水平。

2.3 HPLC测定各萃取部位酚酸含量

通过HPLC检测各组分溶液中5种酚酸的含量。由表7可知，石油醚部和氯仿部不含有酚酸类物质；乙酸乙酯部含有对羟基苯甲酸；正丁醇部位含有3种酚酸，分别为香豆酸，对羟基苯甲酸和香草酸，且总量最大，高达2.094μg·mL-1；水部含有酚酸种类最多，含除香豆酸之外的其他4种酚酸，酚酸总量仅次于正丁醇部，达到1.107μg· mL-1。酚酸类物质的化感作用已被许多学者证实，正丁醇部和水部具有较强的化感作用，这可能与它们含有大量的酚酸类成分有密切关系。

表6 各处理组收获期的地黄形态及生理指标比较

表7 不同萃取部位的酚酸含量

3 小结与讨论

近十年来，学者们对地黄的根系分泌物进行了系列的研究。刘红彦等［19］研究发现，向盆栽地黄中添加地黄茬后土壤或地黄叶等残体均能抑制地黄块根的生长；吴宗伟等［14］研究发现，水培地黄的根系分泌物具有化感作用；李建军等［20］研究发现，地黄块根分泌物和根系溃烂腐解产生的化感物质能抑制地黄种子萌发和幼苗生长；李振方等［21］通过95%乙醇提取地黄的须根，并将其分为不同的萃取部位，发现乙酸乙酯部提取物能抑制种子幼根的伸长生长，地黄须根和地黄茬后土中含有同样的化感物质，地黄收获时散落在田间的须根可能是化感物质的一个重要来源。然而，上述这些研究主要是通过提取少量根际土壤并利用传统的种子发芽生物测试来测定物质是否具有化感作用的。这种方法虽然时间短、效果明显，但却存在2个方面的问题。首先，前人在研究地黄的根系分泌物时所采集的土壤量一般较少。地黄的根系分泌物通过根系分泌和茎叶块根等残体的腐烂将化感物质释放到土壤中，导致化感物质在土壤中分布不均匀，多集中在根系和腐烂的残体附近。当地黄茬后土壤采样量较少时，化感物质的种类和含量可能会受到影响。本研究在已有研究的基础上，比较了不同提取溶剂及提取方法的提取效率和总提物的化感效应，最终采用70%甲醇超声提取的方法。为了满足盆栽试验和后期分析试验的需求，本试验共提取地黄根际和根区土壤200kg，得到的化感物质种类和含量更具有代表性。其次，地黄在生产过程中主要采用种栽繁殖，对种子具有化感作用的物质是否对地黄种栽具有相同的作用还有待探讨。在田间试验中，由于土壤成分复杂以及来自土壤微生态系统的各种作用，很多在生物测试中具有活性的物质，往往在田间试验中失去作用。因此，为了进一步明确地黄的化感自毒物质，本试验同时利用种子发芽生物测试和盆栽试验来测定和验证不同萃取部位的化感作用。研究结果显示，在种子发芽试验中，作用最强的是水部位，其在浓度为4倍时发芽率为51.11%，根长为5.29mm，RI为-0.43；而正丁醇组发芽率为65.56%，根长为7.22mm，RI为-0.22；水组对种子发芽率和幼根伸长生长的抑制作用强于正丁醇组。田间试验结果则表明，正丁醇组对地黄块根发育抑制作用最强。田间盆栽结果与种子发芽试验结果存在一定差异，这表明对种子具有化感作用的物质对块根不一定具有化感作用。已有研究仅通过种子发芽试验就认为，土壤中的某些化感物质就是导致地黄连作障碍的化感物质是不严谨的，需要进一步进行田间试验来验证。

本研究试验结果表明，地黄的乙酸乙酯、正丁醇和水浸提液在不同浓度条件下影响种子的发芽率及胚根伸长，并存在低促高抑现象，高浓度的各处理组均对受试植物的幼根的伸长生长产生明显的抑制作用。在地黄盆栽试验中，水组、正丁醇组和乙酸乙酯组对地黄地上部的生长有一定的抑制作用，但与头茬都没有形成显著差异。田间盆栽试验结果显示，这些部位对地黄块根发育的影响更为显著，其中以正丁醇部位的抑制作用最强。HPLC检测结果也显示，不同萃取部位的化感物质存在较大差异，以正丁醇和水部的含量和种类最多，其中正丁醇部含有香豆酸、香草酸和对羟基苯甲酸，酚酸总含量最高，达到2.094μg·mL-1。杜家方［11］对不同间隔年限地黄土壤中酚酸类成分的研究结果显示，地黄的叶片及块根生长与香豆酸、对羟基苯甲酸和香草酸这3种酚酸类成分呈显著负相关，且这3类酚酸类成分在地黄茬后2～8年的土壤中均呈逐渐下降趋势。本试验的HPLC检测结果也显示，化感作用最强的正丁醇部位，其主要酚酸类物质为香豆酸、对羟基苯甲酸和香草酸。这与其研究结果基本一致，也说明地黄的自毒作用可能主要与这3种酚酸类成分有关。

与水稻、大豆、黄瓜等忌连作植物不同，地黄是典型的具有化感自毒作用的根类药材，地黄等根类中药材的有效成分主要是次生代谢产物。地黄在生长过程中不断在体内积累，并向土壤中分泌次生代谢产物，这些次生代谢物质通过土壤微环境的一系列变化会对地黄块根产生影响，可能会影响地黄块根中有效成分的积累和变化。而这些物质与化感作用存在密切关系［22］。因此，根类药材的化感作用可能并不能完全消除，在研究如何减轻连作障碍的基础上，要保证药材的有效成分不发生变化才具有意义，研究清楚化感物质的作用机制和物质基础，对于改进药材品质、增加药材产量具有重要的意义。

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（责任编辑：张瑞麟）

S567.23+4

A

0528-9017（2016）05-0693-05

2016-03-08

国家自然科学基金 （81373910；81102756）

陈 枫 （1988—），男，河南洛阳人，硕士研究生，主要从事药用植物栽培学研究工作，E-mail：chen_feng2014@126.com。

李 娟，博士，副教授，主要从事药用植物栽培学与化学生态学研究工作，E-mail：juanli2003@126.com。

文献著录格式：陈枫，李娟，聂铭，等.地黄根际土壤不同萃取部位的化感效应研究 ［J］.浙江农业科学，2016，57（5）：693-698.

10.16178/j.issn.0528-9017.20160525