盐酸氨溴索注射剂稳定性及体内药物动力学的深层次评价

张秀磊 钱江辉 任筱青 沙先谊

盐酸氨溴索注射剂稳定性及体内药物动力学的深层次评价

张秀磊 钱江辉 任筱青 沙先谊

目的 深层次评价四种盐酸氨溴索注射剂在生理环境pH条件下的稳定性及体内药物动力学。方法 以pH 7.4磷酸缓冲液模拟血液的生理pH环境，考察四种制剂不同剂量下与其混合后的含量和pH变化；采用随机、自身交叉试验设计，应用HPLC-MS/MS测定盐酸氨溴索血浆浓度，考察四种盐酸氨溴索制剂在比格犬体内的药物动力学。结果 A与B两种盐酸氨溴索注射水针剂在pH 7.4磷酸缓冲液中相对比较稳定；C和D两种注射用盐酸氨溴索粉针剂在低剂量时含量呈现下降趋势，高剂量时含量降低大于10%。四种制剂的缓冲能力具有明显的差别，水针剂的缓冲能力明显强于粉针剂。中、高剂量C、D制剂的生物利用度均明显低于A制剂，提示盐酸氨溴索注射剂配方的差异可能影响药物的生物利用度。四种制剂的药物生物半衰期t1/2随剂量的增加而改变，AUC（0-∞）随剂量增加呈现非线性增加的趋势，表明该药物体内动力学可能为非线性药物动力学过程。结论 盐酸氨溴索水针剂配方中的缓冲盐体系增强了盐酸氨溴索对于PBS的稳定性，有利于提高药物在体内的稳定性。

盐酸氨溴索；缓冲能力；HPLC-MS/MS；生物利用度；质量评价

盐酸氨溴索（Ambroxol hydrochloride）为溴己新的体内活性代谢物，是新一代黏痰溶解剂，临床上主要用于治疗急、慢性呼吸道疾病[1]。黏液高分泌是慢性气道炎症性疾病的重要病理生理特征，可加

重呼吸道气流阻塞，加速肺功能下降，气道黏液的黏弹性主要由其中的黏蛋白所决定，盐酸氨溴索能分解其中的多糖部分，并增加呼吸道黏膜浆液腺体的分泌，减少黏液腺分泌，从而降低痰液黏度，促进黏液排出，对肺泡表面活性物质的合成与分泌也有显著地促进作用，可增加支气管纤毛运动，起到有效排痰、改善呼吸状况的作用[2]。

临床注射用的盐酸氨溴索主要有水针剂和冻干粉针两种剂型。在药品说明书注意事项处明确指出，该药物不能与pH大于6.3的溶液混合，因为pH值的增加将会导致产生氨溴索游离碱沉淀。前期通过对水针剂和粉针剂的制剂配方进行分析，发现两种剂型配方的主要区别在于：水针制剂配方中含有磷酸缓冲液体系，而粉针剂主要辅料为甘露醇。考虑到人体生理环境的pH为7.4，因此本实验拟选择两种盐酸氨溴索水针剂和两种盐酸氨溴索冻干粉针，深层次评价药物的体外稳定性及其体内动力学的差异性，旨在为该药物的内在质量评价与临床用药的安全性提供一定的理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 高效液相色谱仪：Shimadzu LC-15A高效液相仪（日本岛津公司）；色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm）；天平：Sartorius BS210S，Max 210 g，d=0.1 mg，北京赛多利斯天平有限公司；分析天平：Sartorius BT25S，Max 21 g，d=0.01 mg，北京赛多利斯天平有限公司；pH计：编号1231045508，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；API-3000质谱检测器（Applied Biosystems，美国）以及Analyst色谱工作站（1.4.1版本，Applied Biosystems，美国），Agilent公司1100型高效液相色谱仪，包括G1312A四元泵、G1316A柱温箱、G1379A在线脱气机和CTC HTS型控温自动进样器（CTC Analytics，瑞士）。

1.2 药品与试剂 盐酸氨溴索对照品（纯度＞99.6%，中国药品生物制品检定所，批号：100599-200502）；盐酸氨溴索注射液：A厂（国药准字J20140032，规格为每支15 mg/2 ml）；B厂（国药准字H20041473，规格为每支15 mg/2 ml）；注射用盐酸氨溴索粉末：C厂（国药准字H20031344，规格为每支30 mg）；D厂（国药准字H20050243，规格为每支15 mg）。甲醇、乙腈（色谱纯，TEDIA，美国）；其他试剂均为分析纯。pH 7.4磷酸缓冲液（PBS）：按中国药典第四部，取磷酸二氢钾1.36 g，加0.01 mol/L氢氧化钠溶液79 ml，用水稀释至200 ml即得[3]。

1.3 盐酸氨溴索体内外分析方法的建立

1.3.1 盐酸氨溴索体外样品分析方法 色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：0.01 mol/L磷酸氢二铵溶液（用磷酸调节pH至7.0）-乙腈（50∶50，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱温：室温；检测波长：248 nm；理论塔板数按盐酸氨溴索计算不低于2000。

1.3.2 盐酸氨溴索血浆浓度测定方法[4-5]色谱条件：Agela公司Venusil XBP Phenyl column（100 mm× 2.1 mm，5 μm）；采用梯度洗脱（梯度洗脱程序见下表1），流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇；内标为甲苯磺丁脲（100 ng/ml）；柱温 40℃；进样量10 μL。

表1 盐酸氨溴索LC MS/MS流动相洗脱程序表

质谱条件：离子源为电喷雾电离（ESI）源；检测方式：正离子检测；扫描方式：多反应监测（MRM）；喷射电压：5000 V；离子源温度：500 ℃；气帘气流速：10 L/min；雾化气流速：8 L/min；碰撞气流速为：4 L/min；扫描时间：0.2 s；采用定量和定性的离子条件。见表2。

表2 盐酸氨溴索血药浓度LC MS/MS离子条件

1.4 盐酸氨溴索注射剂稳定性评价

1.4.1 盐酸氨溴索注射剂在磷酸缓冲液（pH 7.4 PBS）中的稳定性 根据药品说明书该制剂应避免与pH大于6.3的溶液混合，但考虑到人体血液的pH在7.4左右，应考察制剂输液后在血液环境中的稳定性[6]。以PBS模拟血液的pH环境，评价四种药品在不同剂量条件下的稳定性。根据盐酸氨溴索注射液的临床用药情况，分别考察不同厂家、不同剂量下（60、120、240、480 mg）与100 ml磷酸缓冲液（pH 7.4 PBS）混匀后0、0.5、1.0、1.5、2.0 h的稳定性。

1.4.2 盐酸氨溴索注射剂缓冲能力比较 考察不同厂家的盐酸氨溴索注射液在pH 7.4 PBS溶液中pH的改变。盐酸氨溴索注射液5 ml（粉针剂用注射用水复溶，15 mg/2 ml），以pH 7.4 PBS滴定测定注射液pH的改变。

1.5 盐酸氨溴索注射剂比格犬体内药物动力学评价1.5.1 实验动物 比格犬，普通级，年龄7～8月龄，体重8.0～12.0 kg，24只，雌雄各半。由复旦大学实

验动物中心供应。

1.5.2 实验方案 采用随机、自身交叉试验设计，测定三种剂量四种盐酸氨溴索制剂比格犬体内药物动力学参数。将24只比格犬按雌雄各半随机分为四组，自身交叉静脉注射四种盐酸氨溴索制剂，交叉试验的净化期为7 d。四种制剂的给药剂量均为3、12、48 mg/kg。试验制剂需在给药前用0.9%氯化钠注射液稀释至相同体积，分别于静脉给药前及给药后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24 h由后肢静脉采血1 ml，肝素抗凝，离心10 min（12 000 r/min），分取血浆，-20 ℃保存[7-8]。

1.5.3 样品处理 精密吸取待测血浆50 L置于1.5 ml离心管中，加入甲苯磺丁脲内标甲醇溶液（100 ng/ml）250 μL，涡漩混匀20 s，沉淀蛋白后，离心10 min（12 000 r/min），吸取上清液100 μL，加入100 μL蒸馏水混合[7-8]。在前述HPLC-MS/MS条件下测定，记录盐酸氨溴索与内标的峰面积比值。

1.5.4 数据分析 Cmax用实测数值表示；药时曲线下面积（AUC）用梯形法计算；四种盐酸氨溴索制剂的药物动力学参数的统计学分析，应用t检验，判定药物动力学参数差异的显著性：*P＜0.05为显著，**P＜0.01为非常显著。

2 结果

2.1 盐酸氨溴索注射液用药过程稳定性评价

2.1.1 盐酸氨溴索注射液在磷酸缓冲液（pH 7.4， PBS）中的稳定性 以PBS模拟血液的pH环境，评价四种药品不同剂量（60、120、240、480 mg）条件下在pH 7.4 PBS中的稳定性。结果表明：两种水针剂A制剂与B制剂在pH 7.4 的PBS中相对比较稳定，在低剂量时2 h内含量没有明显变化。两种粉针剂C制剂和D制剂2 h时在低剂量时含量明显下降（＞3%）；高剂量时，含量降低超过10%。见图1。

图1 不同厂家的盐酸氨溴索注射剂在pH 7.4 PBS中的稳定性(n=6)

2.1.2 盐酸氨溴索注射液缓冲能力比较 考察不同厂家的盐酸氨溴索制剂在PBS溶液中pH的改变。结果如图2所示，表明四种制剂的缓冲能力具有明显差别，水针剂的缓冲能力要明显强于粉针剂。粉针剂在少量PBS滴定下，其pH快速达到6，而水针剂在大量PBS滴定下，其pH值始终小于6.0。

2.2 盐酸氨溴索比格犬体内药物动力学

2.2.1 方法学验证[9-10]①专属性：盐酸氨溴索的保留时间为1.43 min左右，内标甲苯磺丁脲的保留时间为3.34 min，其他均为内源性杂质。在所建立的LC-MS/MS分析条件下，药物和内源性杂质均分离完全，内源性杂质不干扰盐酸氨溴索的测定。

②基质效应：取比格犬空白血浆180 μL，加入含不同浓度的盐酸氨溴索标准溶液20 μL，使样品浓度分别为50、500、5000 ng/ml，按1.5.3项下所述方法进行样品测定，以同一浓度盐酸氨溴索标准溶液作为对照，以峰面积比作为检出率，并以检出率与100%标准偏差衡量血浆样品中盐酸氨溴索生物样品

的基质效应。结果表明：低、中、高浓度的生物样品的检出率为90.26%～108.59%，盐酸氨溴索样品与标准品的偏差为-9.74%～8.59%，说明基质效应很小，即无明显抑制也无明显增强作用。

图2 不同厂家盐酸氨溴索注射剂在PBS滴定下的pH变化曲线(n=3)

以上分析方法评价结果显示，建立的盐酸氨溴索体内血浆样品LC-MS/MS方法专属性好，内源性杂质对样品测定无干扰，分析药物与内标及血浆内源性物质达到完全分离，且样品处理简单。精密度及回收率均符合规定，该体内生物样品测定方法稳定、灵敏、重现性好。

2.2.2 四种制剂低、中、高剂量血药浓度-时间曲线和AUC（0-∞）本研究采用随机实验设计，平行观察并比较了比格犬静脉注射四种制剂三种剂量的盐酸氨溴索的药物动力学过程。四种制剂三种剂量盐酸氨溴索血药浓度-时间曲线和AUC（0-∞）如图3所示。

图3 比格犬静滴不同剂量盐酸氨溴索注射剂后的平均血药浓度-时间曲线(n=6)

表3 比格犬静滴不同剂量盐酸氨溴索注射剂后的AUC（0-∞）(g/ml·h)比较(n=6)

由表3结果可以看出，低剂量组（3 mg/kg）B、C、D厂相对于原研药A厂的平均AUC之比分别为98.16%、87.29%、97.76%，其中C厂AUC明显降低约13%，但差异无统计学意义（P＞0.05）；中剂量组（12 mg/kg）B、C、D厂相对于A厂的平均AUC之比分别为95.73%、88.48%、95.94%，其中C厂AUC降低约13%，B与D厂降低约4%；高剂量组（48 mg/kg）B、C、D厂相对于A厂的平均AUC之比分别为94.07%、83.41%、89.50%，其中C厂AUC降低约17%，D厂降低约10%。可以发现，不同剂量的B、C、D厂的生物利用度数值均低于A厂，且C厂的生物利用度最低，提示药物制剂配方的差异可能在一定程度上影响药物的生物利用度。

2.2.3 四种制剂低、中、高剂量t1/2与AUC（0-∞）的比较分析 图4结果显示，四种制剂的药物生物半衰期t1/2随剂量增加而改变，提示该药物体内动力学可能为非线性药物动力学过程。图5结果显示，四种制剂的AUC（0-∞）随剂量增加呈现非线性增加的趋势，进一步表明该药物体内动力学可能为非线性药物动力学过程。

3 讨论

不同厂家的盐酸氨溴索制剂在不同剂量下（60、120、240、480 mg）与pH 7.4 PBS混合后测定含量与pH，结果发现粉针剂在PBS中的稳定性明显低于水针剂，尤其是在高浓度时，其含量在2 h时明显降低。通过比较四种制剂的缓冲能力可以发现：水针剂的缓冲能力要明显强于粉针剂。粉针剂在少量的PBS滴定下，其pH快速达到6，而水针剂在大量PBS滴定下，其pH值始终小于6.0。分析其处方组成发现，A与B制剂中均含有缓冲盐，因此具有较好的缓冲能力，其中B制剂由于采用磷酸二氢钠使注射液pH偏低（pH 4.0左右）。C与D制剂处方中除主药外仅含有甘露醇，不具有缓冲能力，因此遇到较高的pH溶液时，其pH快速增加。

图4 盐酸氨溴索注射剂t1/2与剂量的关系

图5 盐酸氨溴索注射剂AUC（0-∞）与剂量的关系

采用液质联用检测技术建立测定生物样品中盐酸氨溴索的定量方法，方法学指标均可满足盐酸氨溴索制剂药代动力学研究的要求。相对于高效液相色谱法（HPLC），此方法灵敏度高，生物样品用量少，解决了检测灵敏度低的问题。虽然，四种制剂在不同剂量条件下AUC（0-∞）上差异无统计学意义，

但是在数值上可以发现，C制剂在低剂量下其绝对生物利用度已明显降低，并且在高剂量条件下进一步降低到83.41%；D制剂在高剂量条件下绝对生物利用度也出现明显的降低，降低约10%。两种盐酸氨溴索冻干粉针剂的绝对生物利用度的降低可能与制剂的冻干工艺及原料药的差异有关。在前期的药物稳定性研究中已发现，粉针剂在pH 7.4 PBS的环境中，约10%的药物析出，从体内的药物动力学和生物利用度分析结果进一步证明了这两种制剂给药后药物可能在血浆环境中析出，从而降低该制剂的生物利用度。比较静脉滴注不同剂量的四种盐酸氨溴索制剂的药-时曲线和药物动力学参数，经剂量校正后，四种盐酸氨溴索制剂在3、12和48 mg/kg三个剂量组的t1/2与AUC均呈现出非线性动力学的趋势，表明盐酸氨溴索在所考察的剂量范围内（3～48 mg/kg），静脉给药后药物在比格犬体内的药物动力学行为随着剂量的增加可能呈现体内非线性动力学消除过程。由于受种属差异性等生理因素的影响，不同制剂的人体内药物动力学是否会产生差异性以及引起药效的区别，还需要进一步的临床研究与评价。

药品的质量是决定其有效性与安全性的重要保证。在药物制剂处方和工艺研究中，需要全面系统的对影响药物质量的各个因素进行分析和评价，选择合理的试验设计方法以获得药物制剂最全面、最准确的信息，对于药物制剂的研究非常重要。本实验从两个角度充分验证了处方中缓冲盐体系的存在对于提高药物稳定性的必要性和重要性，尤其是原研制剂A体现了“质量源于设计”（Quality by Design, QbD）的制剂研发理念。

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In-depth evaluation of stability and in vivo pharmacokinetics of Ambroxol Hydrochloride Injections

Zhang Xiulei Qian Jianghui Ren Xiaoqing Sha Xianyi

Objective To deep evaluate stability and pharmacokinetics of four ambroxol hydrochloride injections at physiological pH.Methods pH 7.4 phosphate buffer solution (PBS) was used to simulate physiological pH of blood, and the content and pH change of four preparations were measured after mixed with pH7.4 PBS at different dosages. The plasma concentration of ambroxol hydrochloride was determined by HPLC-MS/MS,and pharmacokinetics of four ambroxol hydrochloride preparations in beagle dogs were investigated by randomized,self-crossed design.Results In pH 7.4 PBS,A and B two ambroxol hydrochloride water injection were relatively stable;for C and D two powder injection of ambroxol hydrochloride for injection, content decreased at low-dose, and decreased more than 10% at high-dose.The buffering ability of four preparations was obviously different,and buffering ability of water injection was obviously stronger than that of powder injection.The bioavailability of C and D preparations in medium and high doses was significantly lower than that of A preparation, suggesting that differences in formulation of ambroxol hydrochloride injection may affect bioavailability of drug.The biological half-life t1/2of four preparations changed with increasing dose, and AUC(0-∞)showed a nonlinear increased trend with increasing dose,indicating that pharmaco- kinetics of drug may be nonlinear pharmacokinetic processes.Conclusion The stability of ambroxol hydrochloride in PBS was enhanced by addition of buffer system in formulation of ambroxol hydrochloride injection,which was beneficial to improve in vivo stability of drug.

Buffer capacity;HPLC-MS/MS;Bioavailability;Quality evaluation

R927.11

A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.11.002

复旦大学，上海 201203

张秀磊（1993-），硕士研究生。研究方向：药物新剂型与新制剂。E-mail：15211030022@fudan.edu.cn

沙先谊（1976-），博士，副教授。研究方向：药物新剂型与新制剂。E-mail：shaxy@fudan.edu.cn