多耐药大肠埃希菌NB8株全基因组耐药基因检测

翁幸鐾，糜祖煌，王春新，朱健铭



多耐药大肠埃希菌NB8株全基因组耐药基因检测

翁幸鐾1，糜祖煌2，王春新3，朱健铭4

目的 检测1株多耐药大肠埃希菌NB8株的遗传学背景。方法 病原分离自2012年4月宁波市第一医院住院患者尿液，作16S rDNA和gyrA基因测序、BLASTn比对确认为大肠埃希菌，采用Illumina HiSeq与Ion Torrent PGM两种大规模并行测序仪进行全基因组分析,再行人工测序。最后NB8株和9株已完成全基因组测序的大肠埃希菌耐药基因的比较基因组学研究。结果 多耐药大肠埃希菌NB8株全基因组测序得到一条推定的染色体序列,长4 550 369 bp (内含14个缺口)，得到一条推定的质粒序列,长635 377 bp(内含33个缺口)。从NB8株全基因组数据中挖掘出了β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类、四环素类、多粘菌素的耐药基因，并挖掘出接合性质粒、转座子、插入序列、整合子的遗传标记，以及5大类外排泵基因。结论 多耐药大肠埃希菌NB8株遗传学背景明确，主动外排机制增强也会导致或者增强NB8株的耐药性。质粒、转座子和整合子等可移动遗传元件可以使细菌的耐药性得以快速传播，使受体菌表现为多重耐药。

大肠埃希菌；全基因组；多耐药；耐药基因；可移动遗传元件；外排泵基因

每年超过800万美国女性受尿道致病性埃希菌(UPEC)感染而产生泌尿道感染(UTI)症状[1]，33%女性在24岁时已有UTI史并接受抗生素治疗，超过半数的女性在一生中曾有过UTI史[2]，大于80%的UTI由UPEC引起[3]。国内对UPEC的研究较少，我们曾报告28株多耐药UPEC的耐药基因和毒力基因等研究[4-7]。为深入了解UPEC的遗传学背景，特以Illumina HiSeq与Ion Torrent PGM并行测序仪对一株多耐药大肠埃希菌NB8株做全基因组分析,并从全基因组序列中挖掘耐药基因、可移动遗传元件和外排泵基因，再和9株已完成全基因组测序的大肠埃希菌的耐药基因作比较，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株 大肠埃希菌NB8株分离自2012年4月11日宁波市第一医院一例83岁女性患者的尿液。菌株先以法国生物梅里埃公司VITEK 2-Compact全自动微生物鉴定仪及配套革兰阴性菌鉴定卡鉴定，再以16S rDNA和gyrA基因测序,经GenBank比对确认为大肠埃希菌。

1.2 药物敏感性试验 用上述的微生物鉴定仪及配套的药敏卡做16种药物敏感性检测；红霉素、四环素、美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦的药敏试验采用纸片扩散法，M-H琼脂为法国生物梅里埃公司产品，药敏纸片为英国Oxoid公司产品。再根据2012年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)的标准进行抗菌药物敏感性判断[8]。NB8株对氨苄西林(≥32)、头孢唑啉(≥64)、头孢曲松(≥64)、头孢他啶(≥64)、头孢吡肟(≥64)、氨曲南(≥64)、头孢替坦(≥64)、氨苄西林/舒巴坦(≥32)、庆大霉素(≥16)、妥布霉素(≥16)、丁胺卡那(≥64)、环丙沙星(≥4)、左氧氟沙星(≥8)、复方新诺明(≥320)、红霉素(7mm)、四环素(7mm) 均耐药；对哌拉西林/他唑巴坦(64)、头孢哌酮/舒巴坦(17mm)中介；对亚胺培南(≤1)、美罗培南(27mm)敏感。

1.3 全基因组测序

1.3.1 测序策略 样本DNA采取随机散弹式打断来构建 DNA文库，并使用Illumina HiSeq 与 Ion Torrent PGM 两种平台进行测序。组装之后再利用PCR等方法进行补缺口。

1.3.2 测序流程 同参考文献[9-10]。

1.3.3 组装结果 使用软件将 clean reads 先进行de novo组装后，得到的 contigs除了利用paired-end information得到 scaffolds之外，再与参考基因组：大肠埃希菌SE15 (Accession number: NC_013654) 进行对照与排列顺序，得到推定的一条染色体和一个质粒。全基因组测序委托中国台湾基龙米克斯生物科技股份有限公司进行。

1.3.4 补缺口 针对缺口设计引物，得到PCR产物后再使用 Sanger 测序法，将大部分缺口补充完整。

1.4 生物信息分析

1.4.1 基因注释 使用 Glimmer v3.02与 prokaryotic GeneMark.hmm v2.10f对推定的染色体与contigs 进行 ORF 预测(Start codons 使用 ATG & GTT; Stop codons 使用 TAG & TGA & TAA)，并利用RBSfinder程序找出基因的转录起始点附近的核糖体连接位点。使用 RNAmmer (v1.2)与 tRNAscan-SE (v1.23)，进行 rRNA & tRNA 基因的预测。

1.4.2 功能注释：将预测出的基因段落转成蛋白质序列分别与NCBI 的 nr & microbial RefSeq protein databases & COG databases 以及 KEGG的protein database进行 BLASTP 比对，得到基因注释。

2 结 果

2.1 全基因组组装结果 多耐药大肠埃希菌NB8株经Illumina HiSeq与Ion Torrent PGM测序仪进行平行测序,二种仪器测得序列合并组装后用PCR法补缺口。最终得到一条推定的染色体序列,长4 550 369 bp(内含14个缺口)，和一条推定的质粒序列,长635 377 bp(内含33个缺口)。美国GenBank登陆号：LBIS00000000。共挖掘出5 248个基因，5 023个CDS(蛋白质编码区)，109个假基因，18个rRNAs (包含5S、16S、23S)，85个tRNAs，13个ncRNA。

2.2 全基因组功能注释结果 COG基因功能分类提示NB8株共有3 922个功能基因，按功能分类，可分为3类。第1类为代谢类基因，1 643个(41.89%)，其中糖类转运和代谢基因371个(9.46%)，氨基酸转运和代谢基因359个(9.15%)，产能和储能基因275个(7.01%)，无机铁转运和代谢基因245个(6.25%)，辅酶转运和代谢基因147个(3.75%)。第2类为信息储存和处理基因，629个(16.03%)，其中转录相关基因242个(6.17%)，复制、重组和修复基因208个(5.30%)，翻译、染色体结构和起源基因177个(4.51%)。第3类为细胞过程和信号转导基因，860个(21.92%)，其中细胞壁/膜/外壳起源基因239个(6.09%)，翻译修饰，蛋白翻转，分子伴侣基因基因142个(3.62%)，信号转导基因137个(3.49%)，细胞内运输，分泌和小泡运输基因129个(3.29%)，细胞运动基因122个(3.11%)。另有功能预测基因460个，功能未知基因330个。用KEGG 反应代谢通路分析也得到类似的结果。

同源蛋白来源物种表提示NB8株来源于大肠埃希菌的蛋白有5 003个，占97.5%，还有少量的蛋白可能来源于肺炎克雷伯菌、沙门菌和志贺菌等细菌，需要做进一步的群体遗传学分析。

通过全基因组数据挖掘，NB8株对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类、四环素类的耐药表型和基因型一一对应。①NB8株对β-内酰胺类的耐药表型：对氨苄西林、头孢唑啉、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、头孢替坦、氨苄西林/舒巴坦耐药，对哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦中介，对亚胺培南、美罗培南敏感。基因型检出产β-内酰胺酶基因(3个A类酶：blaTEM-1、2个blaCTX-M-3，1种B类酶：假定的金属β内酰胺酶，1种C类酶：ampC)；PBP靶位挖掘出pbp1B、pbp1C、pbp2、pbp4、pbp5/6、pbp7、pbpAmpH，膜孔蛋白挖掘出ompC、ompE、ompF，但无法在各大数据库检索到突变位点的资料，所以无法确定相关位点是否有突变。②NB8株对氨基糖苷类的耐药表型：对庆大霉素、妥布霉素、丁胺卡那均耐药。基因型检出氨基糖苷类修饰酶(包括1种核苷转移酶基因：ant(3”)-Ⅰ、2种磷酸转移酶基因：aph(3”)-Ⅰb、aph(6)-Ⅰd、1种乙酰转移酶：aac(3)-Ⅱ)。③NB8株对喹诺酮类的耐药表型：对环丙沙星、左氧氟沙星耐药。基因型检出gyrA基因80位TCG(S)突变成TTG(L)，87位GAC(D)突变成AAC(N)；parC基因80位 AGC(S)突变成ATT(I)；挖掘出parE，但无法在各大数据库检索到突变位点的资料，所以无法确定相关位点是否有突变。④NB8株对大环内酯类的耐药表型：对红霉素耐药。基因型检出2种2′-磷酸转移酶：mph(2′)-Ⅰ和mph(2′)-Ⅰ调节子、1种大环内酯类转运ATP 结合/通透酶：macA。⑤NB8株对磺胺类的耐药表型：对复方新诺明耐药。基因型检出2种二氢叶酸合成酶：sul1、sul2，1种二氢叶酸还原酶：dfrA17。6)NB8株对四环素类的耐药表型：对四环素耐药。基因型检出3种耐四环素耐药基因：tetA、2个tetC。7)NB8株对多粘菌素的耐药表型；对多粘菌素耐药。基因型检出了arnA。

通过全基因组数据挖掘，NB8株共挖掘出20个接合性质粒遗传标记(traA、traB、traC、traE、traF、traJ、traK、traL、traN、traP、traR、traU、traW、trbC、trbD、trbE、trbI和3个假定的接合转移基因)、50个转座酶基因遗传标记(YhgA-like转座酶基因、insG、insI、insD、12个转座酶基因、34个假定的转座酶基因)、18个插入序列遗传标记(IS3、IS5、IS6、IS10、IS26、IS66、IS1294、IS6100、ISSd1、4个IS2、2个IS629、3个IS911)、25个整合子和噬菌体整合酶遗传标记(intI、整合酶基因xerC、整合酶基因xerD、前噬菌体 DLP12整合酶基因、噬菌体CP-933R 整合酶基因、前噬菌体CP-933X 整合酶基因、噬菌体整合酶基因、8个整合酶基因、2个假定的整合酶基因、5个假定的前噬菌体P4 整合酶基因、3个假定的噬菌体整合酶基因)、24个外排泵基因(1个ATP结合盒转运体家族(ABC)、1个多药物与毒物外排家族(MATE)、1个小多药外排家族(SMR)、12个主要易化因子超家族(MFS)、9个耐受-生节-分裂家族(RND))。

NB8 株染色体基因组片段序号5 048至5 052中发现1个Ⅰ类整合子，包含dfrA17、ant(3”)-Ⅰ、SMR family、sul1 4个耐药基因盒，见图1。

图1 多耐药大肠埃希菌NB8株染色体基因组发现一个Ⅰ类整合子

Fig.1 Class 1 integron in chromosome of multi-drug resistantE.coliNB8 by whole genome sequencing

2.3 比较基因组学研究 NB8株和9株已完成全基因组测序的大肠埃希菌耐药基因的比对，见表1。10株大肠埃希菌携带外排泵基因的阳性率非常高，这和外排泵首要功能与细胞的正常物质转移和代谢有关，而外排抗生素等毒性物质只不过是其次要和偶然的功能。但无法确定这些外排泵基因的实际表达水平。

表1 多耐药大肠埃希菌NB8株和9株已完成全基因组测序的大肠埃希菌耐药基因的比较基因组学研究
Tab.1 Comparative genomics of genes in multi-drug resistant to E. coli NB8 and other 9 strains of E. coli by whole genome sequencing

耐药基因种类Genetictype基因名称GeneNB8UTI89CFT073536E24377AHSK12O157∶H7EDL933O157∶H7str.SakaiAPECO1耐β-内酰胺类resistanttobeta-lactamsblaCTX-M+ampC++++++++耐氨基糖苷类resistanttoaminoglycosidesaac(3)-Ⅱ+〛+ant(3”)-Ⅰ+〛+aph(3”)-Ⅰb++aph(6)-Id++耐大环内酯类resistanttomacrolidesmacA++++++++++耐磺胺类resistanttosulfanilamidessul1++sul2+耐多粘菌素类resistanttopolymyxinarnA++++++++++耐四环类resistanttotetracyclicstetC++外排泵effluxpumpstolc++++++++++macb+++++++++mdte++++++++++mdtf++++++++++mdtg++++++++++mdth++++++++++mdtk++++++++++mdtl++++++++++mdtm+++++mdtn++++++++++mdto++++++++++mdtp++++++++++acra++++++++acrb++++++++++

3 讨 论

与传统的Sanger测序技术相比,新一代测序(next-generation sequencing,NGS)技术具有超高速、高通量、低成本和高效益的优势，理论上可测出细菌的全部染色体和质粒序列,可读出全部功能基因,包括临床上深度关切的耐药基因和毒力基因。故NGS技术在国内外已逐步用在细菌耐药机制研究和耐药细菌传播途径分析中，如2011年5月份德国O104∶H4E.coli引起腹泻爆发流行的两株流行株TY2482株[11]和LB226692[12]株，再从全基因组序列中挖掘出耐药基因和毒力基因，指导临床治疗。但NGS技术的缺憾为测序读长(reads)较短,通常会包含错误。当基因组中出现大量短重复序列时，无法准确拼接，因此不能测通全长而出现缺口。多耐药大肠埃希菌NB8株经Illumina HiSeq与Ion Torrent PGM两种仪器测序、组装后用PCR法补缺口，得到一条推定的染色体序列(内含14个缺口)和一条推定的质粒序列(内含33个缺口)。

NB8株的遗传学背景明确。NB8株对β-内酰胺类抗生素耐药是因为获得了blaTEM-1、ampC、双拷贝blaCTX-M-3等β-内酰胺酶基因。对氨基糖苷类抗生素耐药是因为获得了ant(3”)-Ⅰ、aph(6)-Ⅰd、aph(3”)-Ⅰb、aac(3)-Ⅱ等氨基糖苷类修饰酶基因。对喹诺酮类抗生素耐药是因为gyrA基因83位TCG(S)突变成TTG(L)，87位GAC(D)突变成AAC(N)，parC基因80位 AGC(S)突变成ATT(I)。对大环内酯类抗生素耐药是因为获得了mph(2′)-Ⅰ调节子、mph(2′)-Ⅰ、macA。对磺胺类抗生素耐药是因为获得了二氢叶酸合成酶sul1、sul2和二氢叶酸还原酶dfrA17。对四环素类抗生素耐药是因为获得了tetA和双拷贝的tetC。对多粘菌素耐药是因为获得了arnA。并且还挖掘出大量介导基因水平转移的接合性质粒、转座子、插入序列、整合子等可移动遗传元件和大量的外排泵基因。

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Genes in multi-drug resistantEscherichiacoliNB8 by whole genome sequencing

WENG Xing-bei1, MI Zu-huang2, WANG Chun-xin3, ZHU Jian-ming4

(1.DepartmentofMedicalLaboratory,NingboFirstHospital,Ningbo315010China；2.DepartmentofBioinformation,WuxiClon-GenTechonologyInstitute,Wuxi214026;China；3.DepartmentofMedicalLaboratory,WuxiPeople’sTechnologyHospitalaffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Wuxi214023China；4.DepartmentofMedicalLaboratory,HangzhouYuhangHospitaloftraditionalChineseMedicine,Hangzhou311106China)

We investigated the genetic background of multi-drug resistantEscherichiacoli(E.coli)NB8. Multi-drug resistantE.coliNB8 was collected from urine sample of an inpatient in Ningbo First Hospital, in April, 2012. Sequencing 16S rDNA and gyrA, BLASTn algorithm were performed to identifyE.coli.Then, whole genome were sequenced by Illumina HiSeq and Ion Torrent PGM,and PCR was performed to fill gaps. Finally, comparative genomics of resistant genes in multi-drug resistantE.coliNB8 and other 9 strains ofE.coliwere performed. Results showed that by whole genome sequencing, a putative chromosome sequence (14 gaps inside) was 4 550 369 bp, a putative plasmid sequence (33 gaps inside) was 635 377 bp. Resistant genes to beta-lactams, aminoglycosides, quinolones, macrolides, sulfonamides, tetracyclines, polymyxin were positive. Furthermore, genetic markers of conjugative plasmids, transposons, insertion sequences, integrons and 5 classes of efflux genes were positive. In conclusion, genetic background of multi-drug resistantE.coliNB8 was clear.Enhancing efflux pumps contribute to resistance. Plasmids, transposons and integrons promote resistance among bacteria, and make recipient

Escherichiacoli; whole genome; multi-drug resistance; resistant gene; mobile genetic element; efflux pump gene

1.宁波市第一医院检验科，宁波 315010，wxb6006@hotmail.com；

2.无锡市克隆遗传技术研究所生物信息学室，无锡 214026；

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.011

R378

A

1002-2694(2016)08-0741-05

2015-09-01；

2016-02-15

宁波市自然科学基金(No.2012A610186)和浙江省中医药基金(No.2011ZB126)资助

3.南京医科大学附属无锡人民医院医学检验科，无锡 214023；

4.杭州市余杭区中医院检验科，杭州 311106

Supported by the Ningbo Natural Science Foundation (No. 2012A610186) and the Zhejiang Traditional Chinese Medicine foundation (No. 2011ZB126).

bacterium to confer multidrug resistance.