神经鞘内转染siRNA-p300对大鼠神经病理痛阈值的影响

王鹏，郝伟，张颖，任立洁，张艳莉，单世民

神经鞘内转染siRNA-p300对大鼠神经病理痛阈值的影响

王鹏，郝伟，张颖，任立洁，张艳莉，单世民

目的：探讨神经鞘内转染p300siRNA(siRNA-p300)对大鼠神经病理痛阈值的影响。方法：成年雄性清洁级SD大鼠27只随机分为假手术组、对照组和实验组，每组9只。对照组和实验组应用坐骨神经压迫损伤建立神经病理性痛模型并鞘内置管，分别鞘内转染无关4μg siRNA和4μg siRNA-p300。假手术组单纯进行模拟手术并注射等量生理盐水。分别于转染前及注射后2、4、6、8、10、12和14 d分别检测3组大鼠痛阈分值，于注射后14 d处死大鼠，取腰段脊髓采用Western-blot法检测大鼠脊髓中p300表达水平。结果：与假手术组(21.22±1.56)比较，对照组(14.33±4.02)和实验组(13.66±2.30)大鼠疼痛阈值在转染后第2 d开始显著降低（P＜0.05）。与对照组(8.98±2.89)比较，实验组(11.23±2.20)大鼠疼痛阈值在转染后第6天开始显著升高（P＜0.05）；假手术组、对照组和试验组p300相对表达量分别为0.11±0.03、0.67±0.18和0.22±0.04，与假手术组比较，对照组和实验组p300表达显著上调（P＜0.05）；与对照组比较，实验组p300表达明显下调(P＜0.05)。结论：鞘内注射siRNA-p300可显著降低大鼠神经病理性疼痛，提高痛阈。

神经病理痛；siRNA；大鼠；p300；神经鞘内转染

国际疼痛研究协会将神经病理性疼痛（neuropathic pain,NPP）定义为由神经系统原发性损害和功能障碍所激发或引起的疼痛。属于一种慢性疼痛，表现为自发性疼痛、痛觉过敏、异常疼痛和感觉异常等临床特征[1-2]。NPP发病机制具有多样性、复杂性，有电生理基础、解剖学、生物化学、分子生物等方面[3]。已有研究显示，组蛋白乙酰化转移酶家族成员P300在神经疼痛方面发挥重要作用，可调节多种神经炎症及疼痛介质的表达[4]。因此，推测P300可能作为神经疼痛治疗的靶点之一。国内罗慧等[5]采用神经鞘内注射siRNA的方法探讨p300对大鼠神经病理痛的影响。本研究制备NPP大鼠模型，采用鞘内注射针对p300小干扰RNA(siRNA-p300)的方法转染大鼠脊髓，检测的转染后大鼠脊髓中p300的表达水平，探讨p300与NPP的关系及其可能机制，为神经病理痛的治疗探寻可能的药物靶点。

1 材料和方法

1.1 动物清洁级健康雄性成年SD大鼠，体质量280～300 g，购自天津医科大学动物实验中心。

1.2 试剂与仪器转染试剂Lipofectamine2000，购自Life Technologies公司；siRNA-p300，由上海吉玛公司合成；兔抗鼠p300多克隆抗体，购自美国Santa Cruz公司；台式微型离心机(Mierofuge18)，购自BechmanCoulter公司；涡旋振荡器(Vortex-GenieZ)，购自购自美国Scilnd公司；纯水系统，购自德国MilliPore公司。

1.3 大鼠模型制备与处理成年雄性清洁级SD大鼠27只，随机分为假手术组、对照组和实验组，每组9只。采用改良腰段鞘内置管法行鞘内置管，麻醉后俯卧固定，取腰5/6间隙，备皮消毒。纵向切开1 cm，钝性分离皮下组织和肌肉，暴露出白色椎板。在两关节突结合处内侧，用5号针尖破膜后用细钢丝引导PE0503导管(预先在导管前端2.3 cm处以3-0慕斯线轻扎两圈，以便置管后的固定，以不阻塞管腔为宜)沿中线方向指向头侧轻柔置入。置入过程中出现鼠尾侧向甩动即穿刺成功，将导管沿引导丝向头端送入2 cm，至脊髓腰膨大段，与皮下筋膜缝扎固定，并经皮下隧道将导管另一端于颈后部引出，外露1.5 cm，再次缝扎固定。导管容量约为10μL。用一段封闭的硬膜外导管罩住导管外口，以防脑脊液外漏。采用坐骨神经慢性压迫性损伤法建立神经病理性痛模型。对照组鞘内转染无关4μg siRNA+20μL Lipofectamine，实验组转染4μg siRNA-p300+20μL Lipofectamine。假手术组单纯进行模拟手术并注射等量生理盐水。siRNA-p300序列为：F: 5'-CCCCAUGGAACAGCAUdTdT-3'，R：5'-AUGCCC UUGGUUUUCCAUGGOGdTdT-3'；无关序列为：F: 5'-TCTGCUTGCCTTCCTGC-3'，R5'-GCTCCTCCGT-GCUUUCAAACAT-3'。

1.4 检测指标

1.4.1 痛阈检测于转染前及转染后2、4、6、8、10、12和14 d分别检测3组大鼠痛阈分值。将一有机玻璃箱置于金属筛网上，待大鼠在有机玻璃箱中适应15 min，采用von Frey纤维丝测右腿机械触诱发痛阈。每只大鼠右后足底取3个不同位点测机械触诱发痛阈，每次间隔5 min，取各次均值进行计算。

1.4.2 p300表达检测于转染后14 d处死大鼠，取腰段脊髓。采用western-blot法检测大鼠脊髓中p300蛋白的表达水平[6]。按照蛋白检测浓度，加入适量4×SDS样本缓冲液，并用RIPA将样本浓度配成终浓度为100 mg/mL。（1）上样、电泳：取10μL蛋白样品点到10％～15％的聚丙烯酰胺凝胶上，80 V电泳1～2 h，分离出不同分子量的蛋白分子。(2)转膜：用4℃预冷的转移缓冲液(含48mMTris-HCI，39mM甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇)，将SDS-PAGE上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。(3)封闭：室温下用含5％脱脂奶粉的TBST(20 mMTriS-HCI，150 mM NaCl，0.1％Tween20)孵育l h以封闭膜上非特异性结合位点。(4)洗膜：用TBST洗膜3次，每次15～20min。(5)一抗：加入所需检测的特异性一抗，4℃孵育过夜。(6)洗膜：用TBST洗膜3次，每次20 min。(7)二抗：用含5％脱脂奶粉的TBST稀释辣根过氧化物酶连接的二抗，室温孵育l h。(8)洗膜：TBST洗膜3次，每次30min。(9)显色：用ECL液显色（1∶1），显色5min。(10)曝光显影，并用图像分析软件分析蛋白信号的相对含量。

1.5 统计学方法统计分析采用SPSS17.0软件进行，疼痛阈值采用均数±标注差(±s)表示，3组比较采用方差分析检验，组间两两比较采用t检验，P＜0.05认为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 疼痛阈值分析与假手术组比较(21.22± 1.56)，对照组(14.33±4.02)和实验组(13.66±2.30)大鼠疼痛阈值在第2 d开始显著降低（P＜0.05）；与对照组比较(8.98±2.89)，实验组(11.23±2.20)大鼠疼痛阈值在转染后第6天开始显著升高（P＜0.05）。见图1。

2.2 p300表达水平比较假手术组、对照组和试验组p300相对表达量分别为0.11±0.03、0.67±0.18和0.22±0.04。与假手术比较，对照组和实验组p300表达上调（P＜0.05）；与对照组比较，实验组p300表达明显下调(P＜0.05)。见图2。

图1 3组大鼠疼痛阈值比较

图2 3组大鼠术后2周脊髓中p300表达水平比较

3 讨论

NPP为由神经系统原发性损害和功能障碍所激发或引起的疼痛，主要表现为痛觉过敏、感觉异常、自发性疼痛等[7]。全球范围内大约有3％的人群正在遭受神经病理性疼痛的困扰，但目前研究对神经病理性疼痛认识水平有限，目前其确切发病机制及病理生理过程并不是十分清晰，且缺乏行之有效的治疗手段，因此进一步完善对神经病理性疼痛发病机制的研究，探索有效的治疗方法，一直是疼痛相关研究领域的热点[8]。目前，大多数研究认为，神经病理性疼痛是由物理性的机械损伤、代谢或营养性神经改变、病毒感染、药物或放疗的神经毒性、缺血性神经损害、神经递质功能障碍等因素引起[9]。近年来的病理生理学研究显示，受伤神经部位的神经细胞膜Na离子通道和电压门控Ca离子通道的表达增高，并释放一些介质，使神经元的正常生理活动发生改变，导致对菲伤害性或微小伤害的外周刺激反应加剧[10]。大量自发放电，不停地向脊髓神经元发放异位冲动，增加脊髓神经元的敏感性和突触与突触之间神经递质的传递，从而引起脊髓水平的兴奋性增高和感觉功能异常，从而引起脊神经感觉神经元对机械、冷热制激的敏感性增强。

p300为组蛋白乙酰化转移酶家族成员之一，是多功能的转录辅助因子，能够乙酰化组蛋白和非组蛋白的方式参与基因转录调控，并参与多种细胞生物活动，包括细胞周期调控，细胞分化和凋亡等病生理过程[11]。目前大多数研究显示[12]，p300可与多种DNA序列特异性结合的转录因子发生作用，包括cAMP反应元件结合蛋白、E2F、c-Jun,c-myb等，因此认为p300是多种DNA结合转录因子的衔接子，它介导了不同的信号通路间进行的对话，并最终决定了某些基因的转录水平。同时研究还认为，p300是一个具有组蛋白乙酰转移酶活性的转录辅助激活因子，在众多哺乳动物神经系统内均有较为丰富的表达[13]。目前的研究证实，其与神经细胞的激活相关，并能通过表观遗传学调控机制介导下游大量相关基因的表达[14]。通过分子生物学技术，对p300表达水平进行干预，有望对下游疼痛基因的转录产生影响，进而成为治疗神经病理痛的重要途径和靶点[15]。

既往有文献报道[16]，p300在神经疼痛方面发挥重要作用，可调节多种神经炎症及疼痛介质的表达，但其确切分子机制并不清楚。在本研究中，我们采用神经病理痛大鼠模型为研究对象，采用siRNA技术，探讨p300对NPP大鼠痛阈的影响。我们发现，与假手术组比较，对照组大鼠疼痛阈值显著降低，说明神经病理痛大鼠模型建立成功。实验组与对照组比较，鞘内注射针对p300的siRNA能够提高NPP大鼠痛阈，说明p300在神NPP的发生方面发挥重要作用。同时我们还检测到siRNA-p300能够显著下调大鼠脊髓内p300蛋白的表示水平，说明p300蛋白参与了NPP发病过程。

本研究提示，p300在NPP发病机制中起到重要作用。但关于p300如何调控神经病理痛的发生发展机制并不清楚，下一步应采用免疫共沉淀等分子生物学技术，进一步探讨p300调控大鼠神经病理痛的分子机制，为神经病理痛的治疗提供新的靶点。

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[16]Zhu X,Li Q,Chang R,et al.Curcumin alleviates neuropathic pain by inhibiting p300/CBP histone acetyltransferase activity-reg⁃ulated expression of BDNF and cox-2 in a rat model[J].PLoS One,2014,9(3):e91303.

（收稿：2016-03-26修回：2016-08-20）

（责任编辑 张淑坤）

Intrathecal Transfer of siRNA-p300 for Analgesic in Neuropathic Pain Rats

WANG Peng,HAO Wei, ZHANG Ying,etal.Department of Anesthesiology,the 5th Central Hospital of Tianjin(300450),China

Objective To investigate the analgesic effective and molecular mechanism for intrathecal injec⁃tion of siRNA-p300 in neuropathic pain rats.M ethods Twenty-seven adultmale SD rats were random ly di⁃vided into sham operation group,control group and siRNA-p300 group with 9 in each group.Rats in the control group and siRNA-p300 group were induced by chronic constrictive injury and intrathecal independent siRNA 4 μg and siRNA-p300 4μg in the control group and siRNA-p300 group respectively.Rats in the sham operated group were intrathecal injection of 0.9％normal saline.The pain score were recorded and compared among the three groups at the time point of 2,4,6,8,10,12 and 14 days.After 14 days of given siRNA-p300,the rats were executed and the p300 protein were tested by western blot assay.Results Compared with the sham operated group(21.22±1.56),the pain threshold in the control(14.33±4.02)and siRNA-p300 group(13.66±2.30)were sig⁃nificant decreased in day 2(P＜0.05).Compared with control group(8.98±2.89),the pain threshold in siRNA-p300 group(11.23±2.20)were significant elevated in day 6(P＜0.05);The p300 relative expression were 0.11±0.03、0.67±0.18 and 0.22±0.04 in sham operated group,control group and siRNA-p300 group.Compared with shamed operated group,the p300 expression was significant evevated in the control and siRNA-p300 group (P＜0.05).Compared with control group,the p300 expression in the siRNA-p300 group was statistical de⁃creased(P＜0.05).Conclusion The neuropathic pain can be decreased by intrathecal siRNA-p300 in neuro⁃pathic pain rats.

Neuropathic pain;small interfering RNA;rats,p300;intrathecal transfer

Q95-33；R338.3

A

1007-6948(2016)05-0471-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.05.015

天津市第五中心医院麻醉科（天津300450）

单世民,E-mail：15022171377@163.com