BALB/c小鼠阴虚型过敏性哮喘模型的建立与评价

王志旺 妥海燕 任远 李荣科 刘雪枫 程小丽

摘要：目的 建立BALB/c小鼠阴虚型过敏性哮喘模型并进行评价。方法 采用腹腔注射与皮下注射卵清白蛋白（OVA）致敏、雾化吸入OVA激发的方法复制过敏性哮喘BALB/c小鼠模型，激发后期合并灌胃甲状腺素复制阴虚型过敏性哮喘模型。在监测饮食、饮水及体质量的基础上，对支气管激发过程中哮喘行为学、肺功能及肺组织病理学等哮喘相关指标进行观测，同时对cAMP、cGMP及肺液清除功能等阴虚证相关指标进行考察。结果 阴虚哮喘模型组小鼠出现明显的哮喘症状，哮喘行为学综合评分明显升高，吸气峰流量、呼气峰流量、潮气量明显下降，呼吸频率增加，肺组织病理学可见明显的炎症反应；同时，阴虚哮喘模型组小鼠进食与饮水量明显增加，而体质量增长缓慢，肺组织湿重/干重比值下降，血清cAMP及cAMP/cGMP升高，cGMP下降，显示小鼠处于阴虚而阳相对亢盛的状态。结论 在OVA致敏、激发的基础上给予甲状腺素，可成功复制BALB/c小鼠阴虚型过敏性哮喘模型。

关键词：阴虚型过敏性哮喘；动物模型；BALB/c小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.015

中图分类号：R228；R259.622.5；R332 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）09-0061-04

Establishment and Evaluation of BALB/c Mouse Model of Anaphylactic Asthma with Yin-deficiency Syndrome WANG Zhi-wang1，2， TUO Hai-yan1， REN Yuan1，2， LI Rong-ke1， LIU Xue-feng1， CHENG Xiao-li1 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for TCM of Gansu Province， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To establish and evaluate a BALB/c mouse model of anaphylactic asthma with yin-deficiency syndrome. Methods Ovalbumin （OVA） was injected to sensitize and was inhaled to stimulate to replicate the BALB/c mouse model of anaphylactic asthma. Thyroxin was used for gavage during late stimulation to replicate the BALB/c mouse model of asthma with yin-deficiency syndrome. On the basis of monitoring food and water intake and body weight， asthma related indexes， such as asthmatic behaviors， respiratory function， lung histopathology， were detected， and yin-deficiency syndrome related indexes， such as cAMP and cGMP， and pulmonary fluid clearance were examined. Results The BALB/c mouse model of asthma with yin-deficiency syndrome showed obvious asthma symptoms； comprehensive scores of asthmatic behaviors increased significantly； inhaling peak flow， exsufflation peak flow， and tidal volume decreased significantly； lung tissue histopathology showed obvious inflammatory response. Meanwhile， food and water intake of BALB/c mouse model of asthma with yin-deficiency syndrome increased significantly； body weight increased slowly； wet/dry ratio of lung tissue decreased； cAMP and cAMP/cGMP increased， while cGMP decreased， which showed that the mice were in the condition of yin-deficiency and yang-excess. Conclusion Combining thyroxin at the basis of sensitivity induced by OVA is a good pattern to successfully replicate the BALB/c mouse model of anaphylactic asthma with yin-deficiency syndrome.

Key words： anaphylactic asthma with yin-deficiency syndrome； animal model； BALB/c mice

近年来，随着环境污染与过敏体质人群的增加，过敏性哮喘（以下简称“哮喘”）的发病率明显增加[1]；另一方面，随着社会观念的变化，偏瘦体质的人（特

基金项目：国家自然科学基金（81460668）；甘肃省自然科学基金（1310RJZA086）

别是女性）越来越多，导致阴虚质偏颇体质人群迅速增加[2]。本实验对阴虚型过敏性哮喘模型展开研究，为该动物模型的建立及其评价提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雌性BALB/c小鼠48只，6～8周龄，体质量16～20 g，兰州兽医研究所，动物许可证号62000600000082。饲养于甘肃中医药大学科研实验动物中心，实验动物实施使用号00000115。

1.2 药物、试剂与仪器

甲状腺片，山东中泰药业有限公司，批号14080303。卵清白蛋白（OVA）、氯化乙酰胆碱、组胺，Sigma公司；cAMP、cGMP ELISA测试盒，成都光海科技有限公司；氢氧化铝，天津市凯信化学工业有限公司。402AI型超声雾化器，江苏鱼跃医疗设备股份有限公司；鼻部暴露/全身暴露吸入染毒系统，CH Technologies；EMKA型动物肺功能检测系统，北京广源达科技发展有限公司；TGL-16G型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；722型分光光度计，上海第三分析仪器厂；BI-2000型医学图像分析系统，成都泰盟科技有限公司。

2 实验方法

2.1 分组、造模与给药

实验小鼠按体质量分层随机分为正常组、阴虚模型组、哮喘模型组和阴虚哮喘模型组，每组12只。自由进食饮水，适应性饲养1周。

实验第1日开始致敏，即哮喘模型组、阴虚哮喘模型组小鼠每只腹腔注射配制的新鲜致敏液（OVA 100 μg+氢氧化铝3 mg生理盐水混悬液）0.2 mL，同时背部皮下注射等量致敏液，正常组与阴虚模型组以生理盐水代替致敏液；第8日同法再致敏1次。第15日开始激发，将小鼠置于暴露系统中，加入激发液（1%OVA），调节雾化速度至2 mL/min，使小鼠均匀吸入激发液20 min，隔日1次，连续28 d，正常组与阴虚模型组以生理盐水代替激发液[3-4]。第29日开始，阴虚模型组与阴虚哮喘模型组小鼠给予甲状腺片药液120 mg/kg（用0.5%黄原胶助悬）灌胃，正常组与哮喘模型组给予生理盐水20 mL/kg灌胃，1次/d，连续14 d[5]。

2.2 指标观察

2.2.1 一般状况 观测动物体质量、呼吸、饮食、饮水等。

2.2.2 支气管激发实验 实验第28、42日进行支气管激发实验。配制含0.2%组胺与2%乙酰胆碱的混合激发液，在暴露系统中按2 mL/min雾化，小鼠吸入120 s。从雾化吸入开始观察10 min内小鼠抓鼻、挠痒及哮喘发作症状等哮喘行为学指标并评分：无抓鼻或挠痒动作计0分，抓鼻或挠痒出现1～3次计1分，4～6次计2分，7次及以上计3分；小鼠无哮喘症状计0分，出现轻微哮喘症状计3分，出现呼吸急促、或呼吸频率明显加快或焦躁不安等哮喘症状计6分，出现严重呼吸困难如急促点头、腹式呼吸等哮喘症状计9分[6]。

2.2.3 肺功能检测 实验第42日，将小鼠置于肺功能检测系统中，启动系统，在时间与事件模式下测定小鼠肺功能。

2.2.4 离体指标测定 实验第43日，麻醉小鼠，摘眼球取血，分离血清，测定cAMP、cGMP水平。断颈处死，小鼠摘取肺脏，于固定位置取肺组织2份。第1份经固定、切片、HE染色，镜下观察肺组织病理学变化，对支气管壁炎性细胞浸润程度进行半定量分析[7-8]；第2份准确称量湿重，充分干燥至衡重后称取干重，计算湿重/干重比值。

3 统计学方法

采用SPSS11.5统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用方差分析，等级资料采用Ridit分析，计数资料采用卡方检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 阴虚哮喘小鼠进食量、饮水量及体质量变化

正常组小鼠实验过程中饮食饮水无明显变化，体质量正常增长；与正常组比较，阴虚模型组和阴虚哮喘模型组小鼠第42日进食量、饮水量明显增加（P<0.05，P<0.01），但体质量增长缓慢，显示出多饮多食、代谢水平升高等阴虚证的症状；哮喘模型组小鼠饮水量明显增加（P<0.05）；提示阴虚与哮喘均可使饮水量增加，哮喘模型小鼠饮水量增加的原因可能与哮喘咳嗽、咽干口燥而致饮水增加有关。结果见表1、表2。

4.2 阴虚哮喘小鼠血清cAMP、cGMP及其比值变化

与正常组比较，哮喘模型组、阴虚哮喘模型组吸入混合激发液后哮喘行为学综合评分显著升高，哮喘动物数明显增加（P<0.01），而阴虚模型组未出现明显异常。结果见表4。

阴虚哮喘小鼠肺通气变化

结合动物肺功能仪检测指标，本实验对哮喘小鼠吸气峰流量（PIF）、呼气峰流量（PEF）、潮气量（TV）与呼吸频率（F）等肺功能指标进行检测。与正常组比较，哮喘模型组、阴虚哮喘模型组小鼠PIF、PEF、TV显著下降，而F显著升高（P<0.01）。结果见表5。

4.5 阴虚哮喘小鼠肺液清除功能变化

本实验在复制慢性哮喘模型过程中，哮喘模型组、阴虚哮喘模型组小鼠肺组织湿重/干重比值显著下降，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01），阴虚模型组小鼠肺组织湿重/干重比值有一定的下降趋势，但与正常组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表6。

4.6 阴虚哮喘小鼠肺组织病理学变化

正常组和阴虚模型组炎症反应不明显，哮喘模型组和阴虚哮喘模型组小鼠肺组织可见支气管上皮细胞肿胀、部分脱落，基底膜增生、变厚，支气管壁充血、肿胀并伴有大量炎性细胞浸润，见图1。小鼠支气管壁炎性细胞浸润程度结果显示，与正常组比较，哮喘模型组和阴虚哮喘模型组小鼠支气管壁炎性细胞浸润程度明显加重（P<0.01），见表7。

5 讨论

中医阴虚模型的复制方法比较多，但造模简单可控的当属甲状腺素法与糖皮质激素法[9]，而糖皮质激素属于常用的治疗哮喘的药物，因此，在复制阴虚哮喘模型时，甲状腺素法是复制阴虚证较适宜的方法。目前，国内外复制哮喘模型最常用的方法为OVA法，即采用OVA通过致敏与激发两步来复制哮喘动物模型[10]。本实验基于文献及前期研究，采用腹腔注射与皮下注射OVA致敏2周、超声雾化吸入OVA激发4周复制哮喘模型，在此基础上采用甲状腺素灌胃复制阴虚哮喘小鼠模型。造模药物剂量选择方面，OVA采用最适宜的剂量，复制出典型的哮喘模型；但考虑到动物的承受能力，特别是阴虚哮喘小鼠体质量增长缓慢、死亡率明显上升等因素，甲状腺素剂量降为120 mg/kg。

中西医结合病证模型的评价方面，既要考虑基于病理学对疾病全过程认识的病，又要考虑基于症候群对疾病现阶段认识的证，同时要结合现代研究的最新成果[11]。三大营养物质与水液代谢是生命活动的基础，阴虚是指机体精血津液（物质）不足与阳（功能）相对亢盛的病理状态。本研究从小鼠的进食量与饮水量、体质量、肺液清除功能等方面评价阴虚证模型的物质代谢水平，从cAMP、cGMP及其平衡方面评价机体机能虚性亢奋的病理状态。本实验结果显示，阴虚哮喘小鼠进食量、饮水量明显增加，而体质量增长缓慢，提示模型小鼠基础代谢率明显上升，出现“多饮、多食、少肉”的典型阴虚症状；血清cAMP及cAMP/cGMP升高、cGMP下降表明机体处于阴虚而阳相对亢盛的状态；而肺组织湿重/干重比值下降显示肺脏处于精血津液不足的虚损状态。

药理学评价主要由药理作用与作用机制2个方面组成，而对动物模型的评价则更应侧重于药理作用，即对病证症状的影响。作为哮喘病，痰、咳、喘是临床最常见的症状，也是评价哮喘模型的最基础指标，但小鼠咳嗽声音太小而不易察觉，痰液难以量化，唯有哮喘引起的症状有明显特征而易于量化。哮喘可引发呼吸异常，如呼吸急促甚至呼吸伴有点头、腹式呼吸等，以及缺氧而引发的神经系统症状如焦躁不安、直立静坐或急促爬刨垫料等异常行为。采用OVA复制的哮喘属于过敏性哮喘，动物会出现鼻腔与皮肤发痒。因此，抓鼻、挠痒也属于易量化的指标。本研究对小鼠抓鼻、挠痒及哮喘发作症状等哮喘行为学指标进行评价，结果显示阴虚哮喘模型小鼠哮喘等行为学指标评分出现明显的变化。肺功能与肺组织病理学是反映肺脏功能与结构的最直接指标，本研究对肺功能指标PIF、PEF、TV与F进行考察，结果提示阴虚哮喘小鼠的肺功能明显下降；病理结果显示，阴虚哮喘小鼠肺组织出现一定的病理学变化，而支气管壁炎性细胞浸润程度明显加重。

综上，在OVA复制哮喘模型的基础上，采用甲状腺素复制阴虚哮喘BALB/c小鼠模型，该造模方法简便、观测指标变化明显且符合西医对病的诊断和中医对证候的认识特点，为研究阴虚哮喘的本质及平喘药物的作用机制提供了较为理想的动物模型。

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