链霉菌CSDX076次级代谢产物Pseurotin A的分离及结构鉴定

钱声艳，李宇真，邵美云，程桂广，保玉心，岳昌武*

（1.遵义医学院医学与生物学研究中心，贵州省微生物资源及药物开发特色重点实验室，贵州遵义563000；2.昆明理工大学化学工程学院，云南昆明650093）

链霉菌CSDX076次级代谢产物Pseurotin A的分离及结构鉴定

钱声艳1，李宇真2，邵美云1，程桂广2，保玉心1，岳昌武1*

（1.遵义医学院医学与生物学研究中心，贵州省微生物资源及药物开发特色重点实验室，贵州遵义563000；2.昆明理工大学化学工程学院，云南昆明650093）

对从赤水丹霞山土壤样品中分离得到的链霉菌(Streptomyces sp.)CSDX076进行液体发酵。利用乙酸乙酯萃取，硅胶柱层析、薄层层析和反相中压柱层析对发酵液中的次级代谢产物进行分离、纯化；通过核磁共振法对纯化的分离产物进行结构鉴定。结果表明，该研究从链霉菌属中成功分离得到次级代谢产物Pseurotin A。采用滤纸片法对Pseurotin A进行抗菌活性测试，Pseurotin A对金黄色葡萄球菌具有抑制作用，其抑菌圈直径为5.0 mm。

链霉菌CSDX076；次级代谢产物；Pseurotin A；结构鉴定

目前临床使用的抗生素一半以上来自放线菌，其来源的生物活性物质超过20 000个，其中抗生素类活性天然产物超过10 000个，在治疗微生物感染和肿瘤等疾病方面发挥了至关重要的作用。但是由于抗生素的滥用等诸多原因，近年来临床上发现的病原菌耐药性问题越来越严重，为许多疾病的治疗与预防带来极大困难，严重威胁着人类健康[1-3]。因此，加大抗生素研发力度，寻找或发现新型抗生素迫在眉睫[4-5]。随着普通生境分离放线菌中发现新抗生素越来越困难，人们开始把目光转向特殊生境或典型生境，并在沙漠[6]、海洋[7]、植物内生菌[8]等特殊生境中发现了新活性天然产物或新来源。

作为自然界中种类和数量最多的药物微生物，链霉菌具有种类繁多，生长速度快，次级代谢产物丰富且成药潜力大、培养简单等特点，并且通过改变其培养条件、基因工程操作等手段，可激活或促进更多结构多样及复杂的新型活性次级代谢产物合成，具有化学合成发现新药等方法所不可比拟的优越性[9-11]。因此，从典型生境中分离链霉菌，利用其生理学特性结合相应的理化及遗传学操作等，可望从中获得新抗生素物质或为已有潜力化合物提供的新菌株来源。

本实验室曾对黔北地区典型生境来源2 000余株放线菌分离菌株进行了筛选和次级代谢产物开发，并在1株梵净山土壤来源的稀有链霉菌分离菌株Streptomycessp. FJS31-2的发酵产物中得到新型卤化II型聚酮类化合物Zunyimycin A及其系列衍生物[12]。在此基础上，课题组利用高分辨质谱分析技术对赤水丹霞土壤中分离纯化的59株链霉菌的发酵产物进行分析，发现链霉菌Streptomycessp. CSDX076[13]可产生多种次级代谢产物。在优化发酵条件的基础上，本研究对该菌的次级代谢产物进行分离与鉴定，采用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术对其结构进行了鉴定，以期为该类化合物发酵及应用提供新的生物来源。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

发酵菌株：链霉菌Streptomycessp.CSDX076（菌保号：CCTCC M2014241）：分离自贵州赤水丹霞山海拔600 m的次生林地10～20cm深的表层土壤，该菌表现出具有抗藤黄微球菌（CGMCC 1.2156）活性[13]。

发酵培养基：葡萄糖4 g，CaCO32 g，麦芽抽提物10 g，酵母抽提物4 g，琼脂粉15 g，加去离子水定容至1 L。

测试菌株培养基：哥伦比亚血琼脂培养基、葡萄糖美兰培养基（真菌培养基）及Mueller-Hinton琼脂培养基：郑州贝瑞特公司。

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色念珠菌（Candida albicans）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）：遵义医学院附属医院保藏。

反相硅胶RP-18：德国Merck公司；薄层层析硅胶G254板及柱层析硅胶（200～300目）：青岛谱科分离材料有限公司；甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等（均为分析纯）：成都科龙化工试剂厂；甲醇、乙腈等色谱试剂（均为色谱级）：北京迈瑞达公司。

1.2仪器与设备

AVANCE III Bruker-500 MHz NMR核磁共振波谱仪：德国Bruker公司；Sepacore中压制备液相色谱系统：瑞士步琦有限公司；HD-21-2紫外检测仪：上海予腾生物科技有限公司；R-210旋转蒸发仪：瑞士步琦有限公司；BSP-400培养箱：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；E002092超级洁净工作台：苏州市金净净化设备科技有限公司；JA2003电子天平：上海越平科学仪器有限公司；ZF-1紫外分析仪：杭州齐威仪器有限公司；DZ-900培英摇床：太仓市实验设备厂；Master-E超纯水机：上海和泰仪器有限公司；二氧化碳培养箱：美国Thermo公司。

1.3方法

1.3.1菌株Streptomycessp.CSDX076活化与发酵

取斜面保存的菌株Streptomycessp.CSDX076的孢子，划线接种于含有150 mL的发酵培养基，28℃静置培养3 d以活化目的菌株。将活化菌株Streptomycessp.CSDX076接种至发酵培养基，28℃静置培养5 d，以获得目的菌株的种子菌。取2环孢子茂密的种子菌的孢子，均匀涂布于发酵培养基表面，28℃静置培养5 d，捣碎固体培养基，搅拌均匀，继续培养3 d。

1.3.2菌株发酵产物萃取

取固体发酵产物（含固体培养基），加入与培养基等体积（即150 mL）的乙酸乙酯，置于落地式摇床，于室温条件下，110 r/min萃取12 h，共萃取3次。收集萃取液，置于旋转蒸发仪中，减压浓缩，回收萃取液，得到粗提浸膏（17 g）。

1.3.3目标代谢产物分离纯化

将获得的粗提浸膏用氯仿-丙酮混合溶剂溶解后，与硅胶按照质量比为1.0∶1.5的比例（即粗提浸膏17 g，加入硅胶25.5 g）混合均匀，待溶剂挥发后得到河沙状的固体，作为硅胶柱层析的样品。取100～200目硅胶300 g，以氯仿作为溶剂，装柱。氯仿∶丙酮=4∶1（V/V）洗脱溶液洗脱，每250 mL为一份进行收集，共收集15份，每份经旋转蒸发仪减压回收氯仿-丙酮洗脱液后，浸膏样品用少量丙酮溶出转移到20 mL西林瓶，薄层层析（thinlayerchromatography，TLC）点板，石油醚∶丙酮=1∶1展开剂展开，用8%硫酸乙醇溶液显色，并用紫外分析仪观察，记录并计算迁移值（Rf），合并迁移值（Rf）相同点的组分，共得到4份粗提品，并对4份粗提品进行抗菌活性测试，合并抗菌活性部分得到无色的粉末（2.782 g）。

具有抗菌活性的无色粉末部分用反相中压柱层析纯化，中压条件：流速20 mL/min，最大柱压40 bar，甲醇∶水= 1.0∶1.5（V/V）洗脱，每份收集250 mL洗脱液，共收集20份，每份用旋转蒸发仪在53℃减压浓缩回收洗脱溶剂后，用少量丙酮溶剂溶解转移到20 mL西林瓶中，TLC点板，石油醚∶丙酮=1∶1展开，在波长为254 nm紫外灯下观察有荧光，随后用8%H2SO4溶液加热显色，并用紫外分析仪观察，记录并计算迁移值（Rf），合并相同迁移值（Rf）的组分，共得到5份粗样品。对5份粗样品进行抗菌活性测试，合并抗菌活性部分得到无色的粉末（126 mg）。

无色的粉末用石油醚-丙酮混合溶剂溶解后，与硅胶按照质量比为1.0∶1.5的比例（即126 mg，加入硅胶189 mg）混合均匀，待溶剂挥发后得到河沙状的固体，作为硅胶柱层析的加样样品。取100～200目硅胶10 g，以石油醚∶丙酮= 3∶1（V/V）洗脱溶液洗脱，每25 mL为一份进行收集，共收集30瓶，薄层层析点板，石油醚∶丙酮=1∶1展开剂展开，用8%硫酸溶液显色，合并迁移值Rf=0.5的化合物，最终得到化合物A。

1.3.4代谢产物结构鉴定

核磁共振谱：称取化合物A 8mg，氘代甲醇溶剂溶解转移到核磁管（溶剂不宜加多，最好不要超过核磁管1.5 cm），放到核磁共振仪中进行测试（在此过程中先开电源，使核磁管悬浮在均匀磁场中）。测试包括：1H NMR谱、13C NMR谱和DEPT谱。

采用电喷雾质谱（electrosprayionizationmassspectrom-etry，ESI-MS）测定：样品加热气化，进入离子化室，随后电离，得到化合物的分子离子峰及其他离子碎片。

1.3.5抗菌活性的测定

用接种环分别挑取鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的单菌落，划线接种至哥伦比亚血琼脂培养基，36℃、5%CO2培养12 h。用接种环挑取白色念珠菌的单菌落，划线接种至葡萄糖美兰培养基，28℃、5%CO2培养12 h。

采用滤纸片法测定抗菌活性。将滤纸片打孔（孔直径为4 mm），121℃、30 min高压灭菌；称取质量为0.2 mg的化合物A溶于100 μL甲醇中，将滤纸片浸泡其中，取出纸片溶剂挥发干后备用。

纯化好的测试菌用一次性拭子（已灭菌）沾取单菌落，置于含5 mL生理盐水的玻璃试管中，润湿拭子头部轻轻在管壁上涂抹均匀，直至菌悬液比浊度0.44～0.56 MCF；用棉签蘸取菌悬液并靠壁旋转，十字交叉再均匀划线涂抹在Mueller-Hinton琼脂培养基上，待平板稍干后将制作好的滤纸片贴于培养基表面，每个滤纸片中心距离＞24 mm，每个平板4个滤纸片，做好标记倒置于微生物培养箱36℃培养17 h观察，测量抑菌圈直径。

2　结果与分析

2.1Pseurotin A分离纯化

以石油醚∶丙酮=1∶1和氯仿∶丙酮=3∶1为展开剂，通过上述分离纯化的方法，得到化合物A，化合物A的薄层层析色谱图如图1所示。

图1　化合物A的薄层层析色谱图Fig.1　Thin-layer chromatography of compound A

由图1可知，化合物A在紫外分析仪波长254 nm处具有荧光，用TLC方法，分别用石油醚∶丙酮=1∶1和氯仿∶丙酮= 3∶1展开剂展开，A迁移值（Rf）约为0.5，8%硫酸显色剂加热显色后，化合物A呈浅黄色。254 nm荧光及TCL板硫酸显示的结果表明，化合物A为单一的化合物。

2.2化合物A结构鉴定

化合物A的结构鉴定：白色粉末，高分辨电喷雾质谱（high resolution electrospray ionization mass spectrometry，HR-ESI-MS）：m/z454.1474[M+Na]+，分子式：C22H25NNaO8，计算不饱和度为11；1H NMR（MeOD，500 MHz）：化学位移8.35（2H，dd，J=8.5，1.2 Hz，H-19，H-23），7.64（1H，t，J= 7.4 Hz，H-21），7.49（2H，m，H-20/H-22）5个氢质子信号；结合13C NMR（MeOD，125 MHz）及DEPT谱图，碳原子的化学位移129.5×2（d，C-20，C-22），131.7×2（d，C-19，C-23），134.9（s，C-18），135.2（d，C-21）可以推断该化合物含有苯环且苯环无取代；化学位移188.7（s，C-6），197.1（s，C-17），199.2（s，C-4）确定该化合物含有3个羰基；氢质子化学位移5.61（1H，m，H-13），5.45（1H，m，H-12）结合碳原子化学位移128.8（d，C-12），137.3（d，C-13），114.4（s，C-3），169.2（s，C-2）可以初步推断该化合物具有2个双键；化学信号69.5（d，C-10），72.9（d，C-11），76.3（d，C-9），结合氢信号化学位移4.66（1H，ddd，J=18.9，6.7，0.9 Hz，H-11），4.53（1H，s，H-9），4.50（1H，d，J=7.4 Hz，H-10）可以得到该化合物有连接氧原子的碳原子存在；化学信号3.33（3H，s，-OMe），1.75（3H，s，H-16）推断出该化合物具有没有耦合的单甲基，化学信号0.97（3H，t，J=7.5 Hz，H-15）及2.08-2.17（2H，m，H-14）的化学位移及耦合常数推断出该化合物含有乙基基团，且乙基官能团是与双键相连接；以上的各原子就共有9个不饱和度，结合该化合物11个不饱和度可以推断化合物还具有两个五元环；综合以上信息，采用SciFinder数据库，该化合物数据及结构特征与Pseurotin A[14]一致，化合物鉴定为Pseurotin A，其结构如图2所示。

图2Pseurotin A的结构Fig.2　Structure of Pseurotin A

2.3化合物A的抗菌活性测定

采用滤纸片法对Pseurotin A进行抗菌活性测试，以鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及铜绿假单胞菌为测试菌株，甲醇为阴性对照。结果表明（见表1），Pseurotin A对金黄色葡萄球菌具有抑制作用，其抑菌圈直径为5.0 mm，而对鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、白色念珠菌及铜绿假单胞菌没有抑制活性。

表1Pseurotin A的抗菌活性检测结果Table 1　Detection results of antimicrobial activity of Pseurotin A

3　结论

随着海洋、沙漠等特殊生境的链霉菌株活性次级代谢产物[15]出现，为抗生素的研发提供物质来源，贵州同时具有喀斯特及早期的丹霞地貌，蕴藏了丰富的微生物资源，具有较大的开发价值。尽管目前已有多篇关于活性化合物Pseurotin A的报道，但其产生菌都是主要为烟曲霉等真菌[16]，未见该类化合物来自链霉菌的报道。本研究通过对从赤水丹霞山土壤样品中分离得到的链霉菌Streptomyces sp.CSDX076的次级代谢产物进行分离及结构鉴定，在链霉菌属中发现化合物PseurotinA，采用滤纸片法对PseurotinA进行抗菌活性测试，结果表明，Pseurotin A对金黄色葡萄球菌具有抑制作用，其抑菌圈直径为5.0 mm，而对鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、白色念珠菌及铜绿假单胞菌则显示无抗菌活性。该研究为典型生境链霉菌次级代谢产物的研究提供理论基础。

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Isolation and structural identification of Pseurotin A fromStreptomycessp. CSDX076 secondary metabolite

QIAN Shengyan1,LI Yuzhen2,SHAO Meiyun1,CHENG Guiguang2,BAO Yuxin1,YUE Changwu1*
(1.Guizhou Key Laboratory of Characteristic Microbial Research&Drug Development,Medical and Biological Research Center, Zunyi Medical University,Zunyi 563000,China;2.School of Chemical Engineering,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650093,China)

TheStreptomycessp.CSDX076 isolated from Chishui Danxia mountain soil samples was fermented by liquid culture medium.The secondary metabolite in the fermented liquid was separated and purified by ethyl acetate extraction,slica column chromatography,thin-layer chromatography and reverse phase medium pressure column chromatography.The structure of purified products was identified by nuclear magnetic resonance method.The results showed that the secondary metabolite Pseurotin A was separated and obtained fromStreptomycessp.successfully.The antimicrobial activity of Pseurotin A was determined by filtering paper method.The results showed that Pseurotin A had inhibiting effect on Staphylococcus aureus,and the diameter of antibacterial circle was 5.0 mm.

Streptomycessp.CSDX076;secondary metabolites;Pseurotin A;structure identification

Q935

0254-5071（2016）10-0112-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.025

2016-03-28

国家自然科学基金（31160004，31460006），贵州省科技学技术基金项目（黔科合J字[2010]2156；黔科合J字[2012]2348；黔科合SY字[2013]3013）；遵义医学院硕士启动基金（F-757）

钱声艳（1984-），女，助教，硕士，研究方向为天然药物化学。

岳昌武（1975-），男，教授，博士，研究方向为微生物天然产物发现与生物合成。