芹菜籽粕中提取黄酮的新技术研究

徐国良，李雄辉，胡居吾，涂招秀

（江西省科学院，江西南昌330096）

芹菜籽粕中提取黄酮的新技术研究

徐国良，李雄辉，胡居吾，涂招秀

（江西省科学院，江西南昌330096）

研究芹菜籽提取油后的芹菜籽粕中的芹菜黄酮物质的提取，并对芹菜黄酮物质进行改性，采用β-葡萄糖苷酶将糖苷型黄酮生物转化为苷元型黄酮，研究酶解温度、酶解时间、酶使用量等因素，确定最佳工艺条件，旨在提高芹菜黄酮物质的药效成分。结果表明，在酶的使用量为0.6，酶水解反应时间2h，体系pH为5，反应温度为50℃的水解条件下，可达到理想的水解效果；通过对制备产品进行相关测定,表明该制备工艺的产品纯度为90.24%，产品得率为10.5%。

芹菜籽;黄酮改性;β-葡萄糖苷酶;糖苷型黄酮;苷元型黄酮

芹菜籽中所含黄酮类化合物具有降低血管的脆性，改善血管的通透性，降低血脂和胆固醇，用于防治老年高血压和脑溢血等作用[1-3]。还具有抗HIV病毒活性[4，5]，改善黄酮的构型，提高黄酮类产物生物利用率的作用[6，7]。

1　糖苷型芹菜黄酮的制备

1.1糖苷型芹菜黄酮的提取

去油脂后的芹菜籽粕，取40g样品粉末，按料液比1∶15加入75%乙醇，85℃回流提取80min，提取2次，过滤，旋转蒸发浓缩成浸膏，将该浸膏通过AB-8大孔树脂对黄酮进行富集纯化，取经AB-8大孔树脂富集后的芹菜粗黄酮产品用盐酸水解，水解产物用乙醚萃取重结晶得到单体化合物。

1.2糖苷型芹菜黄酮的鉴定

1.2.1盐酸-镁粉试验

取适量分离纯化得到的样品于1mL乙醇溶液中，加少量镁粉，然后加浓盐酸四五滴，置沸水浴中加热2～3min，如出现红色，表明含有黄酮类化合物。

1.2.2芹菜黄酮紫外光谱测定

分别取约2mg经分离纯化得到的样品溶解于10mL的乙醇中，用紫外可见分光光度计在200～700nm波长范围内扫描，得到紫外光谱图。

1.2.3芹菜黄酮红外光谱测定

红外光谱测定采用KBr压片法。取100mg左右的KBr于玛瑙钵中研碎，加约1mg经分离纯化得到的样品，研匀，压片，将其在400～4000cm-1范围内扫描，以波长（m）或波数（cm-1)为横坐标，百分透过率为纵坐标，得到该物质的红外吸收光谱。

1.2.4芹菜黄酮质谱测定

样品测定时，先将经分离纯化得到的样品经HPLC分离后进入电离室，以APCI离子源法测定并记录质谱图。

1.2.5芹菜黄酮核磁共振波谱测定

将经分离纯化得到的样品以氘代甲醇或二甲亚砜为测试溶剂，以TMS为内标测定。仪器工作频率1H-NMR为299.9MHz，13C-NMR为75.4MHz。

1.3结果与分析

化合物为淡黄色针晶(甲醇)，熔点340～342℃，HCl-Mg粉反应呈阳性，确定其分子量为270，结合1H-NMR及13C-NMR谱确定化合物分子式为C15H10O5。图1、2分别为化合物的紫外光谱图和红外光谱图。

HCl-Mg粉反应呈阳性，说明该化合物可能为黄酮类化合物。综合理化性质、UV、IR、1H-NMR、13C-NMR及MS分析，确认该化合物结构式见图3。

图1　芹菜黄酮的紫外光谱图

图2　芹菜黄酮的红外光谱图

图3　芹菜黄酮的结构式

2　芹菜黄酮改性试验

2.1原料

去油后的芹菜籽粕。

2.2主要试剂

β-葡萄糖苷酶，从杏仁中提取，2.5活力单位/mg，购于Sigma公司；芦丁（标准品）；乙醚（分析纯）、乙醇（分析纯）、柠檬酸（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯）等。

2.3主要仪器

旋转蒸发器RE-520J、离心机H2050R、冷冻干燥机DZF-6020、紫外可见分光光度计UV-2100。

2.4试验方法

2.4.1芹菜籽总黄酮测定方法

以芦丁为标样，根据黄酮类化合物在250～270nm紫外区有特征吸收，以其吸收的强弱定量测定。试验测定时最大吸收波长为260nm，工作曲线方程为A=0.0887X-0.0023。式中，A为吸光值，X为浓度，μg/mL；线性相关系数为R=0.9998[8，9]。

2.4.2工艺流程

芹菜籽脱油后原料→干燥→缓冲溶液溶解→加酶水解→加乙醚萃取苷元型芹菜黄酮→分离乙醚相→回收乙醚→苷元型芹菜籽黄酮产品。

准确称取50mg脱脂原料于锥形瓶中，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液搅拌溶解，加β-葡萄糖苷酶溶液，搅拌水解2h后加入等体积的无水乙醚，搅拌并快速冷却至室温，将混合液转移至分液漏斗中，震荡后静置分层，分离乙醚相，下层水相用无水乙醚再次萃取后，合并乙醚相，回收乙醚后用无水乙醇充分溶解固形物并定容于100mL容量瓶中，紫外法测定苷元型芹菜籽黄酮含量，计算水解提取率。水解提取率计算公式如下：水解提取率/%=乙醚相中苷元型芹菜籽黄酮总量/原料中黄酮总量×100。在不加酶溶液的条件下重复该试验作为空白对照。

经紫外法测定，脱脂处理后芹菜籽原料中总异黄酮含量为17.3%。

2.4.3酶水解工艺的产品组成分析及纯化效果评价

在最佳酶水解条件下，按2.4.2工艺路线提取苷元型芹菜籽黄酮，回收乙醚后冷冻干燥得到产品，分别计算其产品得率和产品纯度。其中，产品得率/%=产品质量/原料样品的质量×100；产品纯度/%=产品中苷元型芹菜籽黄酮总量/产品质量×100。

2.5试验结果

2.5.1酶用量对水解效果的影响

取50mg脱脂原料用一定体积pH值为5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解后，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0用量的β-葡萄糖苷，在50℃条件下水解2h，剩余操作同2.4.2，测定乙醚相中苷元型芹菜籽总黄酮含量，考察酶用量对酶水解效果的影响。结果表明（见图4），随着酶用量的增加，水解提取率也明显提高，但在酶用量为0.6处，水解提取率有一个突跃点。超过0.6后，水解提取率随酶用量的增加趋势相对缓慢。考虑到酶的价格因素，可选择0.6的酶用量为宜。

图4　酶用量对水解提取率的影响

2.5.2反应时间对酶水解效果的影响

在其他试验条件一致的前提下，改变水解反应时间，考察反应时间对酶水解效果的影响。结果表明（见图5），随着反应时间的增加，水解提取率也明显提高，当反应时间小于2h时，反应时间与水解率关系曲线的斜率有较大的变化。反应时间超过2h后，水解率随反应时间的增加趋势相对缓慢。考虑到实际操作，选择2h的反应时间为宜。

图5　反应时间对水解提取率的影响

2.5.3反应温度对酶水解效果的影响

结果表明（见图6），随着反应温度的增加，水解提取率也相应提高，但在反应温度为50℃处，水解提取率最大，超过50℃后，水解率随反应温度的增加而急剧下降，说明温度过高或过低都会影响酶的活性，从而引起水解提取率的下降。因此，反应的最佳温度为50℃。

图6　反应温度对水解提取率的影响

2.5.4pH对酶水解效果的影响

在其他实验条件一致的前提下，改变水解反应体系pH值，考察pH值对酶水解效果的影响。结果如图7所示。结果表明，水解提取率在反应体系pH值为5时达到最大，pH值过高或过低都会使水解提取率迅速下降，说明β-葡萄糖苷酶的最适pH为5。

图7　反应温度对水解提取率的影响

3　结论

本工艺选择对糖苷类结构具有良好水解能力的β-葡萄糖苷酶作为水解酶，比较系统地研究了其酶水解的最佳工艺条件。结果表明，在酶的使用量为0.6，酶水解反应时间2h，体系pH为5，反应温度为50℃的水解条件下，可达到理想的水解效果。通过对制备产品进行相关测定,表明该制备工艺的产品纯度为90.24%，产品得率为10.5%。

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Study on New Technology of Extracting Flavonoids from Celery Seeds

Xu Guo-liang,Li Xiong-hui,Hu Ju-wu,Tu Zhao-xiu
(Jiangxi Academy of Sciences,Jiangxi Nanchang 330096)

This paper studied the extraction of Flavonoids from celery seed oil of celery seed meal,and the celery flavonoids was modified,the β - glucosidase will glycoside flavonoids biological into aglycone type flavonoids to improve the effective components of celery seed flavonoids,and studied the factors of enzymatic hydrolysis temperature,hydrolysis time,enzyme dosage,the optimum process conditions were determined to improve the efficacy of celery flavonoids. The results showed that the enzymatic hydrolysis reaction time was 0.6,the reaction time was two hours,the reaction temperature was pH 5,the reaction temperature was 50 ℃; Through the determination of the preparation of the products,the purity of the product was 90.24% and the yield was 10.5%.

Celery seed; Flavonoids of modified; β - glucosidas; Favone glycoside; Flavone aglycone

TQ914

A

2096-0387（2016）05-0004-04

国家自然科学基金项目（31260400）。

徐国良（1964-），男，副研究员，本科，研究方向：天然产物。