朗格汉斯细胞表面分子与尖锐湿疣复发的相关性

范向华 缪 旭 林 桦 施 健

朗格汉斯细胞表面分子与尖锐湿疣复发的相关性

范向华 缪 旭 林 桦 施 健

目的: 确定朗格汉斯细胞(Langerhans cells，LC)表面分子与尖锐湿疣(condyloma acum inatum，CA)复发的相关性。方法: 采用免疫组化方法对正常包皮、CA初发和复发患者皮损组织中LC进行CD1a、S100、HLA-DR标记，并对其表达强度进行半定量分析。结果: 正常对照组、CA初发组及CA复发组CD1a免疫组化染色IOD值分别为7644.84±2865.10、4075.62±2410.39和2308.08±1256.34；S100分别为4400.34±2962.29、1815.78±1013.35及1414.46±1337.13，CA组织中LC的CD1a及S100分子表达较正常组织显著下降(P＜0.05)，在复发组尤为明显。HLA-DR IOD值分别为583.91±592.85、2262.87±2983.09和1191.75±1698.36。HLA-DR的表达在CA初发组和复发组均强于正常组，但复发组较初发组下降。结论: HPV感染人体后，会导致HPV感染的免疫逃避，造成CA的持续感染和易复发。

尖锐湿疣； 人乳头瘤病毒； 免疫组化； 朗格汉斯细胞

尖锐湿疣(CA)是临床常见的性传播疾病(sexually transmitted diseases，STD)，在国内监测的STD中发病率为第三位[1]。CA治疗后极易复发，短期难以根治。免疫机制为影响CA转归的主要因素，其决定病毒被清除或长期在体内存活继而引起相关肿瘤[2]。LC为树突状细胞(dendritic cell，DC)系统中的一种独特类型，作为皮肤、黏膜的抗原提呈细胞，在免疫系统中起重要作用。HPV感染后，LC在数量、密度、形态和功能上亦有不同程度的改变[3]。LC表面有多种分子，其中CD1a、S100和HLA-DR被认为是LC区别于其他DC的标志性表面标记[4]，并在LC的各种生物学行为中起主导作用。

本研究通过免疫组化标记正常皮肤组织、CA初发和CA复发患者皮肤LC表面功能分子CD1a、S100和HLA-DR，并测定三组皮肤组织LC表面功能分子表达水平，进而分析及探讨其与HPV感染和复发的相关性。

1 资料与方法

1.1 病例资料 40例尖锐湿疣患者来自2009-2015年本院门诊就诊患者。均符合尖锐湿疣诊断标准[1]。排除标准:合并有其他局部感染或性传播疾病、慢性严重感染、严重系统疾病、糖尿病、精神病、器官移植、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等；近期内系统使用过糖皮质激素及免疫调节剂或免疫抑制剂等。其中初发患者20例，男13例，女7例，年龄20～61岁，平均34.25岁；病程1周～1年，平均63.30天。复发组20例，男12例，女8例，年龄21～63岁，平均32.90岁，复发病程以复发皮损至本次就诊时间计为3天～9个月。初发病程与复发病程无统计学差异(P＞0.05)。正常对照组10人来自于包皮环切术后正常包皮，病理及HPV试剂盒检测为阴性，年龄16～38岁，平均33.5岁。

1.2 试剂 抗CD1a、S100、HLA-DR抗体、DAB显色试剂盒及HRP偶联的山羊抗兔二抗购置自福州迈新公司；封闭血清购置自Sigma公司。

1.3 方法 所有组织予10%福尔马林溶液固定后常规制成蜡块，对石蜡切片标本和正常包皮组织分别予ELIVISION二步法进行CD1a、S100、HLA-DR免疫组化染色，采用OLYMPUSCX41显微镜及江苏省捷达软件工程公司JD-801病理图文工作站，相同曝光条件下取图，每张切片在高倍镜(10×40)下随机选择5个不连续视野，用Image pro-plus 6专业图像分析软件对图像进行半定量分析，计算出每张切片的累积光密度值(IOD)。

2 结果

2.1 LC表面分子免疫组化染色 对三组标本LC表面分子CD1a、S100、HLA-DR进行免疫组化染色，其中棕色部分为阳性染色。CD1a、S100染色标本中，阳性染色LC数量和形态方面，正常包皮组织中见表皮内较多阳性染色LC，细胞结构轮廓清晰，胞体呈圆形、椭圆形或不规则形，树突状突起较多且细长，可见二级突起(图1a，1d)；初发组CA皮损表皮中LC数目较正常包皮组织减少，LC细胞结构轮廓尚清晰，胞体呈类圆形、椭圆形或不规则形，树突状突起减少、变短(图1b，1e)；复发组CA皮损表皮中LC数量明显减少，胞体较小，树突状突起明显减少、缩短或消失，部分LC结构不完整，个别标本表皮局部LC消失(图1c，1f)。LC表面分子CD1a、S100阳性染色强度方面，CA患者较正常对照组明显下降，且复发组下降尤为显著。而HLA-DR染色标本中，正常对照组阳染细胞数量较少，胞体多呈类圆形，树突状结构不明显(图1g)；CA初发组则较正常对照组数量明显增多，胞体及分枝清晰(图1h)；CA复发组中阳染细胞数量虽仍较正常对照组增多，但较初发组下降，胞体小且分枝短小(图1i)。在LC表面分子HLA-DR阳性染色强度方面，CA患者初发及复发组均较正常对照组升高，但复发组较初发组下降。

2.2 免疫组化染色IOD测定 采用图像分析软件进行半定量分析发现，并采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。在CD1a、S100免疫组化染色中，CA初发及复发组IOD值显著低于正常对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，复发组较初发组IOD值降低，两组有统计学差异(P＜0.05)。而对于HLA-DR，CA初发组较正常对照组增高(P＜0.05)，复发组IOD值虽仍较正常对照组增加，但较初发组降低，且未见统计学差异(P＞0.05)，见表1。

3 讨论

LC来源于骨髓造血干细胞，为一种特殊类型的树突状细胞。正常免疫状态下，当遭遇感染或炎症后，LC的数量、密度较正常反应性增加，主要发挥摄取、加工、处理抗原的作用，同时亦会发生形态学变化，逐步离开表皮移行至局部引流淋巴结，并将抗原呈递给T辅助细胞，在协同刺激因子的作用下使之活化，从而启动免疫应答。LC表面分子CD1a、S100和HLA-DR为LC发育成熟的不同阶段的标记并在免疫活动中承担不同角色[5，6]，其中CD1a是标记人LC细胞的最可靠方法[7，8]。随着LC不断成熟，其吞噬和处理抗原的能力下降，而呈递抗原和激活特异性T细胞的能力不断加强。本研究显示，CA皮损中，CD1a阳染LC数量较之正常组织明显下降，细胞出现胞体变小，分枝变少，且其IOD值明显降低，这些改变在复发组尤为明显。HPV感染后，其病毒抗原仅在终末分化成熟的皮肤或黏膜上皮细胞内表达[9]，而表皮中的LC通过其伸展的树突结构形成扩张性网络以识别外源性抗原[10]。当抗原与LC表面受体Langerin结合后进入胞内，与Birbeck颗粒结合，再通过CD1a的特殊结构通道表达于LC表面，从而为进一步激活T细胞做好准备[6]。CA组织中LC的数量、形态及功能分子的这些改变大大降低LC摄取和处理抗原的能力，进而进一步影响抗原传递和特异性T细胞的激活。而S100分子被认为是LC的活化标记，表达于成熟LC[11，12]。LC通过S100调节T细胞内钙离子浓度，参与激活T细胞的过程[13]，本研究显示，CA组织中S100阳染 LC数量、形态及表达强度出现与CD1a相似改变，表明HPV感染后，LC的成熟活化明显受到阻碍，从而直接影响其抗原递呈功能，进而影响T细胞激活。HLA-DR是人类主要组织相容性复合物(MHC-II)类分子的主要抗原，表皮中主要表达于成熟的LC表面，在抗原递呈中充当第一信号的作用。其通过将抗原从胞内囊泡传递到细胞表面，进而被CD4+T细胞识别进行抗原传递，是LC细胞实现抗原递呈功能的前提和必需条件[14]。本研究表明，初发组CA患者中，HLA-DR较正常对照组表达增强，说明HPV感染上皮组织后，刺激了HLA-DR的表达，机体发挥免疫保护作用。而复发组CA患者，HLA -DR虽仍较对照组增加，但差异无统计学意义，且较初发组下降，表明随着病程的进一步发展，病毒抗原刺激引起的免疫保护反应不能抗衡病毒的免疫逃避机制，导致HLA-DR介导的抗原提呈作用下降。

表1 CA患者和正常对照组表面分子免疫组化染色IOD测定 (¯x±s)

图1 LC表面分子表达(IHC，×400)

本研究通过免疫组化染色观察正常对照组、CA初发组和CA复发组LC表面三种分子表达，并进行半定量分析，发现LC表面分子CD1a、S100表达强度在CA患者均有显著下降，且复发组下降尤为显著，这一改变降低了LC的抗原呈递功能，从而导致HPV的持续感染和复发。其发生机制与HPV感染后表皮的E-cadherin蛋白的降低直接相关[15]。而HLA-DR在CA组织中表达强度虽有增强，尤其在初发期，一定程度上有利于LC抗原递呈，对HPV感染起到一定保护作用，但随着病程发展，其表达及所发挥的保护性作用下降。以上表明，HPV感染人表皮组织后，LC的抗原处理和传递功能受到了影响，尤其在复发患者中影响更为显著，从而导致HPV感染的免疫逃避，造成CA的持续感染和易复发。

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Relationship between the surfacemolecules of Langerhans cells and recurrence of condyloma acum inatum

FAN Xianghua，MIAO Xu，LIN Hua，SHIJian.
Department of Dermatology，Nantong First People's Hospital，Nantong 226001，China Corresponding author:MIAO Xu，E-mail:mx730129@163.com

Objective:To determine the relationship between the surface molecules of langerhans cells (LC)and recurrence of condyloma acuminatum(CA).Methods:The expression of CD1a，S100 and HLADR of LC was measured by immunohistochemical technique，and their semi-quantities were analyzed by graphic software in skin samples of control group，primary CA group and recurrent CA group.Resu lts:In control group，primary CA group and recurrentCA group，the IOD of immunohistochemical staining of CD1a were 7644.84±2865.10，4075.62±2410.39 and 2308.08±1256.34；The IOD of S100 were 4400.34±2962.29，1815.78±1013.35 and 1414.46±1337.13.The staining intensity of CD1a and S100 in CA decreased significantly when compared with control group(P＜0.05)，with an even more decrease in the recurrent CA group. The IOD of HLA-DR were 583.91±592.85，2262.87±2983.09 and 1191.75±1698.36 in the three groups respectively.The staining intensity of HLA-DR was increased in primary and recurrent CA groups，when compared with control group，but the expression in recurrent group decreased when compared with primary group. Conclusion:After infection of HPV，immune escapewill occure and lead to the persistence and recurrence of CA.

Condyloma acuminatum；human papillomavirus；immunohistochemical staining；langerhans cells

南通市社会事业科技创新与示范计划项目(编号:HS2014048)

南通市第一人民医院皮肤科，江苏南通，226001

缪旭，E-mail:mx730129@163.com